蛋白质组学

SPA的提取

 

SPA提取的方法很多,包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。现将常用的方法介绍如下:

1.煮沸提取法

⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂 培养基上,37℃培养20h~24h。

⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下,配成10%(V/V)的悬液。

⑶ 水浴中煮沸1h,迅速冷却至4℃,4 000r/min离心20min,去沉淀。

⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5,然后4 000r/min离心30min。

⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解,然后12 000r/min离心20min。

⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精,充分混合后,.4 000r/min离心20min。

⑺ 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS 液溶解,12 000r/min离心20min。

⑻ 上清液即为粗提SPA液。

⑼ Sephadex G100过柱,上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱,流速控制在每管2ml~3ml/20min,收集流出液。

⑽ 测OD275nm值及用对流免疫 电泳检测每管的活性,将有活性的各管合并、浓缩或冻干。

2.溶菌酶消化法

⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液配成10%~15%的悬液。

⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37℃水溶搅拌24h。

⑶ 置4℃冷却后,以12 000g离心30min。

⑷ 取上清,调pH值至7.0。

⑸ 加硫酸铵,边加边搅拌,使溶液呈80%的饱和度,4℃过夜。

⑹ 12 000g离心30min。

⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。

⑻ 透析或过Sephadex G50除盐,即为粗制的SPA制品。

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