蛋白质组学

等电聚焦方法分离蛋白分子原理介绍

 

等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术,等电聚焦中,蛋白质分子在含有载体 两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸,在电场中形成正极为酸性,负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷,因此可以在电场中移动;当蛋白质迁移至其等电点位置时,其静电荷数为零,在电场中不再移动,据此将蛋白质分离。

等电聚焦中,只有在凝胶两端给以高电压时,才能获得较好的蛋白质条带分辨率,这就需要非常有效的凝胶冷却系统(否则会导致烧胶),即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高,并可方便的同时比较多种蛋白质样品,所以平板胶用在等电聚焦上的居多。

由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感,若要好的重复性,制备蛋白样品时一定要小心,要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外,蛋白质-脂类、蛋白质-蛋白质相互作用可引起电荷改变,进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质-蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能,等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。

等点聚焦实验的缺点主要是要求使用无盐的溶液,而蛋白质在这种溶液中会发生沉淀作用,等电点试验蛋白样品中的成分要停留在其各自的等电点位置,因此对于在等电点不溶或者发生变性的蛋白质中不太适合。

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