蛋白质组学

专家点评:如何预防双向凝胶电泳中的水平条纹

 

在此我们着重讨论了水平条纹的原因和预防。在对任何双向条纹问题进行问题排查时,必须记住两件事:1)水平条纹是由第一向(等电聚焦或IEF)中的不完全聚焦引起的,而2)垂直条纹是由第二向(SDS-PAGE)中蛋白分离 不佳引起的。

第一向的伏特小时数过量

延长聚焦时间不一定能提高分辨率。实际上,它可能引起水平条纹。一些蛋白样品更易聚焦,因此必须对每个样品类型及每种缓冲液独立开展伏特小时数的优化,以确定稳态的IEF模式。

第一向的不完全聚焦

不完全聚焦也会引起水平条纹(Rabiloud 2000)。确保总的伏特小时数适用于所使用IPG胶条的长度和pH范围。聚焦不止一种样品类型,或同时聚焦不同pH范围的IPG胶条(即在同一个聚焦盘中)常常被忽视,但也是其中一个样品不完全聚焦的可能解释。IEF槽设定了整个盘的总电流限制。如果某个样品导电性较好,它将吸引大部分电流,减慢了托盘中其他蛋白样品的聚焦。这导致不完全聚焦和水平条纹的出现。因此,电导率相差很大的样品应当单独运行。

蛋白过载

上样到IPG胶条上的蛋白总量通常取决于胶条的长度以及观察结果所使用的染料(详见下表)。某些情况需要更多考虑,如某个蛋白占了总蛋白的大部分。血清白蛋白就是如此,它占了血清总蛋白的70-90%。因此,将建议量的蛋白上样可能使其他许多蛋白无法显示,因为它们被白蛋白所遮盖。在这些情况下,抑制通过上样更多蛋白来补偿的冲动 – 这可能使水平条纹变得更糟。相反,利用Aurum™ Affi-Gel® Blue mini columns去除血清白蛋白,随后将建议量的蛋白上样。

在杯上样时将太多蛋白上样到样品杯中,或使用IPG胶条进行预运行,都会导致高蛋白载量,从而使蛋白聚集。这会导致某一蛋白在等电点(pI沉降)沉淀,并引起水平条纹。略微提高IPG胶条的溶胀体积(~10%)可能使聚焦改善。下文关于使用还原-烷基化及更强去垢剂的建议也能帮助减少蛋白之间的相互作用,从而解决一些问题。

表. 样品上样到IPG胶条的指南。

IPG胶条长度

7 cm

11 cm

17 cm

18 cm

24 cm

每个胶条的溶胀体积

125 μl

185 μl

300 μl

315 μl

410 μl

蛋白载量

银染

5-20 μg

20-50 μg

50-80 μg

50-80 μg

80-150 μg

考马斯亮蓝G-250

50-100 μg

100-200 μg

200-400 μg

200-400 μg

400-800 μg

样品制备问题

离子净电荷的任何污染将影响等电聚焦,并引起水平条纹(Rabiloud,2000)。常见的污染包括盐、去垢剂、肽段、核酸、脂类和酚醛化合物。以极低电压运行时(PROTEAN® IEF槽的默认值为50 μA/胶条),若IEF的目标电流很早就达到,则离子污染也很明显。如果设定的伏特小时数不足以去除离子污染并实现蛋白的平衡聚焦,那么较低电压会导致IEF运行延长和水平条纹的出现。有时,这可能导致IPG胶条过热或燃烧。解决问题的最简单办法是降低蛋白样品的离子强度。如果您知道问题在于样品中的盐,那么试试脱盐柱或透析。Bio-Rad的ReadyPrep™ 2-D cleanup kit能够去除大部分离子污染和盐。

一些带电荷的去垢剂,如SDS,能够包被蛋白,并彻底改变它们的净电荷,最终影响它们的等电点,导致条纹出现以及IPG胶条中样品的损失。

样品的核酸污染也会导致水平条纹的出现(Görg 1997)。许多蛋白与核酸结合,产生了蛋白-核酸的混合物,每个都有着不同的等电点。在等电聚焦之前用核酸酶处理样品,可去除样品中的核酸(Garfin and Heerdt 2000)。或者,在精胺存在时通过超速离心也可去除核酸(Rabiloud 1996)。

包含唾液酸且带负电荷的多糖也能产生与核酸类似的水平条纹。不带电荷的多糖通过阻塞凝胶孔,阻碍样品进入IPG胶条,以及在物理上阻止聚焦,而导致条纹出现。超速离心通常足以去除碳水化合物。

此外,多肽的氨甲酰化也能使个别蛋白产生电荷异质性,尽管在某些条件下常常形成离散的斑点串 – 正如使用宽pH梯度一样 – 但斑点间的弥散也可能存在。蛋白样品应当使用高纯度尿素制备,切勿加热至30°C以上。

样品制备方面导致水平条纹的最后一个原因是二硫键形成(Walsh 1998)。在双向电泳之前,若蛋白样品中存在二硫键,则它们是随机存在于分子 内部或分子之间的。二硫键形成产生了多种蛋白构象,包括较小的pI变体(在双向凝胶上显示为单个蛋白点的变宽)以及同一蛋白的多聚物(以点、幻影点、缺失点的条纹尾和拖尾出现)。防止二硫键的形成能避免这些假象。二硫键假象在两种情况下特别成问题:1)碱性蛋白的分析,及2)较长IPG胶条的使用。因二硫键形成而造成的水平条纹可利用ReadyPrep reduction-alkylation kit结合IPG胶条的杯上样(Bio-Rad bulletin 4006216)来减少。

蛋白溶解度差

未能彻底溶解样品中的所有蛋白将引起水平条纹。双向电压中所使用的标准样品缓冲液中的主要组分是尿素、非离子去垢剂(如NP-40)或两性去垢剂(如CHAPS)及还原剂(如DTT)。此混合物中包含的其他组分,如硫脲(Rabiloud 1998)或新型去垢剂,特别是氨基硫代甜菜碱家族中的那些(如ASB-14)(Rabiloud 1996)也能改善膜蛋白的溶解性。这些试剂的综合作用是通过更好地溶解蛋白的疏水区域以及减少因蛋白中的氢键或与IPG凝胶基质的相互作用而产生的聚集。另外,在IEF前通过离心去除不溶蛋白也是一种好的做法,能防止它们干扰其他蛋白进入凝胶基质。

电渗流

作为碱性蛋白等电聚焦时的主要问题,电渗流也能引起水平条纹,因为水从阴极运输到阳极。水流可减慢蛋白向相反方向迁移,导致聚焦不完全。此外,IPG胶条在阴极端的脱水可缩小凝胶的孔大小,导致蛋白迁移减慢和聚焦不完全。脱水还能导致蛋白聚集,从而形成水平条纹。这个问题的解决方案包括用新鲜水浸泡过的芯取代阴极的纸芯,向溶胀/样品溶液中加入有机改性剂,如甘油、异丙醇或甲基纤维素(Görg 1997)。

在下一篇文章中,我们将讨论双向凝胶上垂直条纹的预防,敬请留意。

参考文献

Bio-Rad Laboratories, Cup loading tray for the PROTEAN IEF Cell instruction manual, Bio-Rad bulletin 4006216

Garfin D and Heerdt L (eds) 2-D Electrophoresis for Proteomics: A Methods and Product Manual, Bio-Rad bulletin 2651 (2000)

Görg A et al., Very alkaline immobilized pH gradients for twodimensional electrophoresis of ribosomal and nuclear proteins, Electrophoresis 18, 328–327 (1997)

Rabilloud T, Solubilization of proteins for electrophoretic analyses, Electrophoresis 17, 813–829 (1996)

Rabilloud T, Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis, Electrophoresis 19, 758–760 (1998)

Rabilloud T, Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods, Springer, Berlin (2000)

Walsh BJ and Herbert B, Setting up two-dimensional gel electrophoresis for proteome projects, ABRF News 9, 11–21 (1998)

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