蛋白质组学

默克公司关于HIS*TAG实验过程中常见问题与解决方法

 

1、蛋白无法与Ni-NTA His·Bind树脂结合

目的蛋白无 HisTag 序列

——测序 以确定连接处序列和阅读框是否正确。检查是否存在内部翻译起始位点(若 HisTag 序列构建于目的蛋白N 端),或翻译提前终止(若 HisTag 序列构建于目的蛋白C 端)

HisTag 序列空间难以接近

——变性条件下纯化蛋白;或将 HisTag 序列构建于目的蛋白另一末端

HisTag 序列已被降解

——检查穿过组分中有无带有 HisTag 的片段

结合条件不对

——检查所有溶液的 pH 值和组成成分尿素的解离常导致 pH 值的变化。应在使用之前测定缓冲液pH 值,迅速投入使用确保体系中没有鳌合剂和还原剂存在;咪唑的浓度太高也会导致蛋白不能与树脂结合

目的蛋白在漂洗步骤提前被洗出

——洗脱条件过于严格降低咪唑浓度,或增加缓冲液pH 值

HisTag 标签被部分隐藏/屏蔽

——降低洗脱条件的严格程度。变性条件下纯化目的蛋白

缓冲液条件不正确

——检查漂洗缓冲液的 pH 值和组成确保体系中不含鳌合剂及还原剂

2、蛋白在纯化过程中形成沉淀

温度过低

——改为室温纯化

蛋白形成聚合物

——尝试加入增加溶解度的试剂,如0.1% Triton×-100 或Tween-20,高达10mM β-ME 或1mM THP,高达2MNaCI 或帮助稳定蛋白的因子,如 Mg2+。某些情况下,可能需要在纯化过程所有缓冲液中加入这些成分以保持蛋白的可溶性

3、目的蛋白无法洗脱

洗脱条件太温和(蛋白可能以聚合物或多聚体形式存在)

——以 pH 梯度或咪唑梯度洗脱,确定最佳洗脱条件

蛋白洗脱时在柱中沉淀

——变性条件下进行洗脱。以在离心管中结合、洗脱的小量批次方式进行纯化,以避免局部蛋白浓度过高

4、目的蛋白与杂蛋白一起洗脱出来

结合和漂洗缓冲液的条件不够严格

——在结合和漂洗缓冲液中加入10-20mM 咪唑

色谱柱载量相对过大减少

——Ni-NTA His·Bind 树脂或 Ni-IDA His·Bind 树脂用量

杂蛋白与目的蛋白结合,共纯化下来

——加入10 mM β-ME 或1mM THP 以避免杂蛋白与目的蛋白之间形成二硫键,加大漂洗缓冲液的盐浓度,或增加去污剂浓度,加入乙醇/甘油以破坏蛋白之间的疏水作用

杂蛋白是目的蛋白不完整产物

——检查是否存在可能的内部翻译起始位点(若HisTag 序列构建于目的蛋白C 端),或翻译提前终止(若 HisTag 序列构建于目的蛋白N 端)避免目的蛋白在纯化过程中降解,如保持在4℃进行操作,使用蛋白酶抑制剂等。

5、树脂变色

Ni 离子流失或被还原

——确保体系中无螯合剂(Ni 离子被螯合掉之后,树脂变白色)或还原剂(树脂变棕色)

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