蛋白质组学

溶菌酶的相对分子质量测定方法

分子量测定的实验方法与强兵利器

一、实验目的和内容

目的:1. 通过本次实验的学习与操作,使学生在实验过程更好的理解SDS-聚丙烯酰胺 凝胶(PAGE)测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据;

2. 要求学生掌握电泳原理以及SDS-PAGE 垂直板电泳分离蛋白质技术;

3. 熟悉垂直板电泳操作原理和方法,凝胶染色与脱色方法,凝胶图谱 的绘制与计算;

4. 了解在电泳中分子 量标准物的使用。

内容:1.SDS-PAGE电泳 的原理:SDS使蛋白质的变性作用,以及此实验中采用的使不连续PAGE胶(分离胶和浓缩胶)的原理;

2.SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定的原理:凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关;

3.电泳的操作:制胶、加样、电泳、拨胶、凝胶染色与脱色;

4.蛋白条带的观察以及分子量的估算。

二、实验仪器与试剂

1.实验仪器

SDS-PAGE电泳设备,电炉,脱色摇床

2. 实验材料及试剂

实验材料:蛋清(S1)、粗分离样品(S2)、离子交换层析中穿透峰下降段样品(S3)、离子交换层析洗脱峰样品(S4),橡胶手套

实验试剂:2×上样缓冲液、10%SDS、30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液(1.5 mol/LpH8.8 Tris-HCl 缓冲液)、浓缩胶缓冲液(0.5 mol/LpH6.8 Tris-HCl 缓冲液)、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly电泳缓冲液、1%琼脂糖溶液、染色液、脱色液

三、实验步骤

(一)蛋白样品的处理

取200µL 上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中,加入200µL 的2×上样缓冲液,混匀,轻轻盖上盖子,封口膜封紧瓶口以免加热时迸出,在100℃沸水浴中加热3~5min,取出后10000r/min 离心10min,取上清待用。

(二)SDS-PADE实验步骤(适用于大板,若为天能公司的小板,参考附录中的方法)

1.电泳玻璃板洗净,并把玻璃板在灌胶支架上固定好。( 试样格(梳子)临用前用无水乙醇擦拭,让其挥发至干。)

2.用电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶,煮沸溶解后冷却至55℃左右,加入制板槽槽内封板。(固定玻璃板时,两边用力一定要均匀,防止夹坏玻璃板.)

3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5cm左右,之后加少许蒸馏水,静置30分钟。(凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直,并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。)

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置25分钟。(样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。)

5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。(要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.)

6.加样5个,空出第一个孔,从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中蛋清(S1)和Marker加样量为2µL,S1、S2、S3、和S4加样量为10µL。为了练习和比较上样量的影响,可以加20µL的S1~S4作为对照(注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。)

7.电泳槽中加入缓冲液,接通电源,进行电泳,开始电压恒定在160V,当进入分离胶后改为240V,溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时,停止电泳。

8.凝胶板剥离与染色:电泳结束后,用专用工具撬开短玻璃板,从凝胶板上切下一角作为加样标记,然后放在大培养皿内,加入染色液,42℃染色40min左右。(剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。)

9.脱色:染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次,再用脱色液脱色,直到蛋白质区带清晰。

10.将凝胶室温保存于10%甘油水溶液中,至凝胶扫描分析。

11.凝胶扫描仪扫描并进行数据分析,求出溶菌酶的相对分子质量。分析各样品中溶菌酶相对含量的变化。

附表1

浓缩胶 (10mL) 双蒸水 0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP
4% 6.1mL 2.5mL 1.3mL 100μL 10μL 100μL

附表2

分离胶 (20mL) 双蒸水 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP
12% 6.6mL 5mL 8mL 200μL 8μL 200μL

汇总所有实验结果,完成下表:

样品

体积

mL

蛋白浓度mg/mL

总蛋白

Mg

活力

u/mL

比活力

u/mg

总活力

U

回收率

%

提纯倍数

S1

V1=

          100 1

S2

V2=

             

S4

V4=

             

其中:总活力=比活力×体积

回收率=回收的样品活力占总活力的百分数

提纯倍数=提纯的比活力与初始比活力的比值

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