蛋白质组学

SPA的纯化

 

1.DEAE-Sephadex A-25离子交换层析

⑴ 用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液平衡DEAE-Sephadex A-25柱。

⑵ 加样后,用0.1mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱12h~14h。

⑶ 改用0.4mol/L NH4HCO3缓冲液洗脱,流速0.15ml~0.2ml/min,收集流出液,测OD275nm。

⑷ 测SPA活性(以对流免疫 电泳),能与人及猪正常血清产生沉淀线的各管合并。

⑸ 浓缩或冻干保存。

2.Sphadex G100凝胶过柱法

装柱、加样,以0.05mol/L pH7.4 PBS 洗脱,收集洗脱液,如上法测定活性和蛋白含量。

3.亲和层析法

(1) 猪IgG的制备:取正常猪血清,硫酸铵提取 球蛋白,再过DEAE-纤维素-32柱,制得纯化的IgG,以0.1mol/L NaHCO3液平衡,配成4mg~5mg/ml溶液。

(2) 偶联:将固体溴化氰1.2g溶于20ml蒸馏水中,倾入容积为15ml的Sepharose-4B中,搅拌,同时滴加2mol/L NaOH使pH维持在11.0,反应8min,用500ml预冷的0.1mol/L NaHCO3在2号砂芯漏斗上洗脱已活化的Sepharose-4B(在90Sec内洗脱完毕),迅速加入IgG液15ml,于4℃缓慢搅拌过夜,次日以PBS充分洗涤,至洗出液OD280nm<0.02为止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱,以封闭残余活性基团,再以PBS洗至中性为止。

(3) PBS亲和层析:将粗制SPA溶于PBS液中,加入IgG-Sepharose-4B柱,流速0.2ml/min,以PBS洗至OD280nm<0.02为止,换用0.1mol/L pH2.3甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱,流速0.2ml/min,收集洗脱液,即为纯化的SPA,对流电泳检查SPA活性,收集,浓缩,保存。

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