蛋白质组学

蛋白质双向电泳过程与体会

 

双向电泳IEF (sigma)IEF(not IPG)/SDS-PAGE最简单的装备推荐如下,适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组 的,嘻嘻!

IEF用Biorad的圆盘电泳槽 (不行用国产的吧,不推荐),SDS-PAGE用六一厂的就可以了(ft,六一厂应该给我money吧,给你做广告了)(money不是很多的强烈推荐六一的,买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧,呵呵)

BIO-RAD 的圆盘电泳槽,国产的不推荐,因为 上槽 Biorad 的铂金丝凹进去了一点,不是很进去,而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈,影响电聚焦。

双向电泳

1.蛋白质样品制备

秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1 小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5 M尿素,5mM 碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃育30min,期间搅动几次,28度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳。或者-70度保存

2 蛋白质浓度测定

按Garrels(1983)的程序,稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸,冰浴30min后,4℃,4000 r/min离心15min,弃上清,再加入100μl冷丙酮,同上离心5min,弃上清,冻干沉淀,用100μl PBS 溶液复溶,并按Bradford(1976)的程序测定蛋白质浓度。说实话,好象Bradford法不太好做

2.3.1 电聚焦(IEF)

2.3.1.1 玻管准备

干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部,在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子,买原装的也可以,实在不行自己也可以做的,1ml 的移液管,内径1.5mm左右的,长度取18cm,用玻璃刀做,呵呵,很容易的;玻璃管的处理,先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr,用自来水冲后;用双蒸水冲,用双蒸水泡至少1hr,中间至少换2,3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时,用双蒸水冲,(不能用自来水冲),然后双蒸水泡至少1 个小时,中间换3,4 次水,可多泡一会。最后泡在无水乙醇里面1hr,轰干就可以用了.

2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦

灌IEF的配方

为3.09克尿素

1.125 ml 10%NP-40

1.125ml 水

0.735ml 30%屏息现案 (ACR 28.38 BIS 1.62)

0.15 ml Am 3.5-10

0.375ml Am 5-7

8卫生 10%AP

1.8卫生 TEMED

用注射器吸好胶液,装上7号针头,将7号针头插入玻管底部,边推注射器边提针头,直到标记处,用微量进样器小心加入少量水,可见明显的界面出现,让其聚合1小时以上,适当长一点的时间好一些,我一般是头天下午灌胶,第2 天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后,除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液,加样80μg,上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH 的界面。即可进行电泳。电极液为:上槽(负极)为50m mol/L NaOH 液,下槽(正极)为25m mol/L H3PO4。按200V×15min,300V×30min,400V×18h,1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特别是冬天,我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度 暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好.

2.3.1.3 电泳后的凝条处理

电聚焦完毕后,用注射器吸满水,套上一个200μl的枪头,当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然,刚开始做的时候肯定不熟,很不爽,有时候你会唱 想哭却又哭不出来,呵呵,熟悉了就快了,注射器 枪头 玻璃管必须为一直线,消息不要把注射器的头搞断了。取一胶条,用双蒸水洗净两端,按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段,各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜,次日用酸度计分别测定各段的pH值,以凝胶长度为横坐标,pH值为纵坐标作图,即为等电点标准曲线。漫漫挤,管子,200 卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200 卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来,注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑。绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿!还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了。那些说什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵!就跟你用考染IEF 胶条一样的,带,可能先在12%的TCA 里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了。不过在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿。

注意到下级液 磷酸 部分的胶条没,是不是有一节约2cm左右,比较突出,没有膨大的部分呀!只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢,大约3cm左右,呵呵!

对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS,62.5m mol/L Tris-HCL(pH6.8),10%甘油,5%β-巯基乙醇,0.1%溴酚蓝]进行二次平衡,第一次20min,第二次25min。第2 次的溶液为新的。一般我是把第2次用过的当成第一次的用 。平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿。

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