蛋白质组学

蛋白质分析技术

 

第一节 蛋白质分离纯化与鉴定的基本原理

一、蛋白质的理化性质
(一)蛋白质的两性电离

pI:当蛋白质溶液处于某一pH时,蛋白质解离成正、负离子的趋势相等,即成为兼性离子,净电荷为0,此时的溶液的pH称为~。

体内大多数蛋白质:pI≈pH 5.0。在pH 7.4,大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质(如鱼精蛋白、组蛋白)和酸性蛋白(如胃蛋白酶和丝蛋白等)。

(二)蛋白质的胶体性质

1.蛋白质:生物大分子 ,MW:1~100万,大小:1~100nm
2.维持蛋白质胶体稳定因素
蛋白质亲水基团→吸收水分→水化膜→防止蛋白质沉淀析出
蛋白质表面带有电荷→稳定胶体→防止蛋白质沉淀析出

(三)蛋白质的变性、沉淀和凝固
1.蛋白质变性(denaturation)
2.蛋白质沉淀
(1)疏水测链暴露→蛋白质聚集→沉淀(变性)
(2)等电点或去水化膜→蛋白质沉淀(非变性)
3.复性(renaturation)与不可逆变性
(1)renaturation:蛋白质变性程度较轻,去除变性因素后,有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原来的构象和功能,称为~。
(2)不可逆变性:蛋白质变性后,空间构象被严重破坏,不能恢复,称为~。
4.蛋白质的凝固作用(protein coagulation)
蛋白质经强酸、强碱作用变性后,仍能溶解于强酸、强碱中,若将pH调节至等电点,则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物,此絮状物仍能溶解于强酸、强碱中,这种现象称为~。

(四)蛋白质的紫外吸收
蛋白质:Tyr和Trp,280nm有最大吸收值,
故A280∝ protein浓度
(五)蛋白质的显色反应
1.茚三酮反应(ninhydrin reaction)
茚三酮 + 蛋白质 → 蓝紫色化合物(在570nm有最大吸收值)。
2.双缩脲反应(biuret reaction)
CuSO4 + protein or peptide → 紫色或红色

二、分离纯化蛋白质的意义

1.要研究某种蛋白质的结构 与功能,生产高活性的蛋白质类激素、酶等,必须separation和purification。
2.在基因工程 下游工作中,从“分泌型”的细胞质或从“包涵体”中获取具有生物活性的、纯度好的高蛋白质产品,需要separation和purification

三、蛋白质分离纯化的前处理
(一)生物样品的选择和处理
1.样品的选择:有效成分含量高、来源丰富、保持新鲜、实验条件恒定、取材工艺简单、有综合利用价值等。2.样品的处理
保存:-10℃冰箱临时保存,-20℃冰箱短期保存,-70℃冰箱长期保存。
预处理:包括去除脂肪、结缔组织等。
耐高温的成分:烘干长期保存。
有些样品可先冻干粉,再在冰箱中长期保存。

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