蛋白质组学

蛋白产物的检测实验

 

一、组织蛋白的裂解提取:
1.分别取-70℃保存的各组动物的样品(半个脑、0.5g肌肉),放入小离心管中,在冰浴上以PBS 充分洗涤2次,除去残留血液。
2.用无菌手术剪和镊子将大鼠肌肉剪碎(脑样品不用剪碎),放入另一小离心管中,于0℃以PBS充分洗涤,4℃,3000 rpm离心5分钟。
3.吸出上清夜,尽量将管壁上的液滴吸净,将组织碎片转移至组织匀浆管内。
4.取2ml的裂解缓冲液(预冷至0℃),加入20μlAprotonin,20μl Trypsin,20μl NaoN4,20μl的PMSFb,20μl的leupeptins和2μl的DTT,混匀后加入匀浆管内,在组织匀浆器上冰水浴匀浆,注意转速不超过50000 rpm。4℃放置2h,10000 rpm 4℃ 离心10分钟(可延长),吸取上清液(蛋白液)-20℃保存。

二、蛋白的含量测定—染料结合法
(一)基本原理:考马斯亮蓝G-250(CBBG-250)具有红色和青色两种色调,在游离状态下呈红色型,一旦与蛋白质结合就变为青色,色素的最大吸收波长从465nm移到595nm,测定595nm处光密度值的增加即可进行定量。
(二)标准曲线的绘制:
分别在5个1.5ml appendoff管中各加入1μg/μl的BSA 0、1.25、2.5、5、10μl,以0.15mmol的NaCl补足至100μl,每管各加入考马斯亮蓝染料溶液1ml,室温放置2min。用1cm光径的微量比色杯测量,取A595吸光度值对标准蛋白浓度作图,画出标准曲线。
(三)样品中蛋白含量的测定:
将裂解液作二十倍稀释后,按照标准曲线测定待测样品的A595,从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。

三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(一)在蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中,SDS和蛋白以1.4:1的比例结合形成复合物,确保蛋白质的解离状态,并尽量减少多肽亚基间的聚合。这种凝胶电泳的特点是可以对样品进行浓缩,并具有分子筛效应,因而大大提高了样品的分辨率。
(二)试剂:
1. 30%丙烯酰胺溶液:29%(w/v)丙烯酰胺1%(w/v)N,N-亚甲双丙烯酰胺,溶于去离子水,室温下棕色瓶中避光保存。
2. 1.5mol/l Tris• Cl( PH 8.8):取91g的Tris base加水至近500ml,用浓HCl调节PH至8.8,室温保存。
3. 1.0 mol/l Tris• Cl( PH 6.8):取30.5g Tris base 加水至近250ml,用浓HCl调节PH至6.8,室温保存。
4. 10% 过硫酸铵:去离子水配制,配10ml,4℃保存,一周内使用。
5. 加样缓冲液:2%SDS 50mMOL/L Tris•Cl(PH6.8) 10%甘油 50mMOL/L DTT 0.1%溴酚蓝
6. 电泳缓冲液:25mmol/ltris.cl( PH 8.0) 25mmol/l甘氨酸 0.1% SDS( PH 8.3)
(三)操作步骤:
1.配制分离胶(8%,10ml):
去离子水4.6ml ; 30%丙烯酰胺溶液2.7 ml ; 1.5M Tris(PH 8.8)2.5 ml ; 10% SDS 0.1 ml ; 10%过硫酸铵0.1 ml ; TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)0.006 ml
2.加入TEMED以后,迅速混合并灌注在胶板内,注意留出灌注成层胶所需空间(梳子的齿长再加1㎝)。用水封胶。室温下(约20分钟)聚合。
3.聚合后弃去水封,用滤纸吸干。
4..配制积层胶:
去离子水2.7ml ; 30%丙烯酰胺溶液0.67 ml; 1.5M Tris(PH 6.8)0.5ml; 10% SDS0.04ml; 10%过硫酸铵0.04ml ;TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)0.004 ml
5.先插入梳子,然后加入TEMED混匀后立即在聚合的分离胶上灌注积层胶,小心避免混入气泡,凝胶垂直放置于室温下(积层胶聚合的同时,把样品和加样缓冲液混合,100℃加热3min使蛋白质变性)。
6.成层胶聚合完全后 (20分钟),小心移出梳子,把凝胶板转移至电泳装置上,准备上样。
7.上样:小心将微量加样器插入样品孔上方,轻轻推入样品40μl,防止注射器内气泡进入孔内(Maker加20μl)。
8.电泳:将垂直电泳槽中加入电泳缓冲液(液面中间高于两边)。接上电源开始电泳。开始电压50V,当染料进入分离胶后(约0.5h),电压增加到100V,继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部后切断电源(约2h)。
9.取胶:用刮勺撬开玻璃板,取下凝胶用于Western blot分析。

四、Western blot分析
(一)基本原理:Western blot是针对蛋白质产物的一种较灵敏的检测方法。它把凝胶电泳分离后的多肽从凝胶转移到固相支持物,并用针对特定氨基酸的抗体做为探针进行检测,

4.封闭液:5%(W/V)脱脂干奶粉;25mM Tris (PH 8.0);12.5mM NaCl;0.05% Tween-20,配成1000ml
5.显色液:6mgDAB+9mlPBS+1ml0.3%CoCl+30%H2O210μl
(三)操作方法:
1.戴手套切取八张与凝胶大小一致的滤纸和一张硝酸纤维素滤膜于转移缓冲液中。
2.戴手套安装电转移装置,在电极上平放两张浸过转移缓冲液的滤纸,然后把凝胶放在滤纸上,再把硝酸纤维素膜放上,最后放上两张滤纸(要准确对齐,各层间无气泡)。
3.安装转移装置,加入转膜缓冲液(膜正胶负)接通电源,电压30V,12-16h(通常过夜)。转移结束后,取出硝酸纤维素膜,切去一角作标记。注意:为避免短路,不要切去凝胶一角做标记。
4.转移后的硝酸纤维素滤膜用丽春红S染色、洗膜以确定转膜是否成功
5.洗膜:电泳带出现后,先用去离子水漂洗,再用PBS在杂交箱洗3次(37℃,10min)。
6.滤膜的封闭:将滤膜放入带盖的塑料平皿中,加入封闭液,盖上平皿盖,室温平摇1~2h(可省去)。
7.与一抗反应:将一抗用封闭液稀释成1:500,加入装有硝酸纤维膜的平皿中,37℃轻摇2h。
8.滤膜的清洗:滤膜用PBS漂洗3次(37℃,10min)。
9.与二抗(酶联二抗)的反应:将二抗用封闭液稀释成1:500,加入装有硝酸纤维膜的平皿中,37℃摇动1~2h。
10.DAB显色:
11.用数字显像仪对滤膜进行图象拍照和分析。

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