蛋白质组学

蛋白质组学入门问题FAQ

常见问题———

HPLC 篇
1 . HPLC 灵敏度不够的主要原因及解决办法
样品量不足:解决办法为增加样品量
样品未从柱子中流出:可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
样品与检测器不匹配:根据样品化学性质调整波长或改换检测器
检测器衰减太多:调整衰减即可。
检测器时间常数太大:解决办法为降低时间参数
检测器池窗污染:解决办法为清洗池窗。
检测池中有气泡:解决办法为排气。
记录仪测压范围不当:调整电压范围即可。
流动相流量不合适:调整流速即可。
检测器与记录仪超出校正曲线:解决办法为检查记录仪与检测器,重作校正曲线。
2 . 做 HPLC 分析时,柱压不稳定,原因何在? 如何解决?
原因可能有: 

泵内有空气,解决的办法是清除泵内空气,对溶剂进行脱气处理;
比例阀失效,更换比例阀即可。
泵密封垫损坏,更换密封垫即可。
溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气,必要时改变脱气方法;
系统检漏,找出漏点,密封即可。
梯度洗脱,这时压力波动是正常的。
3 .我购买的 HPLC 柱验收测试时柱压过高,请问为什么?
柱压过高是 HPLC 柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面,而且常常并不是柱子本身的问题,您可按下面步骤检查问题的起因。

拆去保护柱,看柱压是否还高,否则是保护柱的问题,若柱压仍高,再检查;
把色谱柱从仪器上取下,看压力是否下降,否则是管路堵塞,需清洗,若压力下降,再检查。
将柱子的进出口反过来接在仪器上,用 10 倍柱体积的流动相冲洗柱子, ( 此时不要连接检测器,以防固体颗粒进入流动性 ) 。这时,如果柱压仍不下降,再检查;
更换柱子入口筛板,若柱压下降,说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质,正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高,请与厂商联系。一般情况下,在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器 便可避免柱压过高的问题, SGE 提供的 Rheodyne 7315 型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
4 .液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?
筛板堵塞或柱失效,解决办法是反向冲洗柱子,替换筛板或更换柱子。
存在干扰峰,解决办法为使用较长柱子,改换流动相或更换选择性好的柱子。
双向电泳篇
1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽 ,直接跑 2D 的一向吗?
一般情况下是可以的。但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完 1D 和 2D 胶后,会有很多横向条纹。所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。

2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面?
这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条。由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量( 80 %满)的矿物油。

3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)?
电流的平方和功率成正比。电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子 ,从而对等电聚焦产生影响。

4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高?
刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的 pH 区域移动。

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