蛋白质组学

连续提取免疫球蛋白法

 

(一)试剂及配制
1.饱和硫酸铵液
2.各种磷酸盐缓冲液
⑴ 0.2mol/L原液

⑶ 0.005Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液100ml,加H2O至2 000ml
⑷0.025 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10Mol/L pH8.0 PB液500ml,加水至2 000ml。
⑸ 0.035 Mol/L pH8.0 PB液
取0.10.1 Mol/L pH8.0 PB液700ml,加水至2 000ml。
⑹ 0.10Mol/L pH5.8PB液
A: 920ml
B: 80ml
H2O 加至 2 000ml
⑺ 0.40Mol/L pH5.2pB液
a液.0.40Mol/L NaH2PO4液
NaH2PO4·2H2O 62.40g
H2O 加至 1 000ml
B液.0.40Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 143.4g
H2O 加至 1 000ml
取a液 960ml
b液 40ml
混合即可。
⑻ 0.01 Mol/L pH8.0PBS
取0.10Mol/L pH8.0 PB液 100ml
NaCl 8.20g
H2O 加至 1 000ml
3.DEAE-纤维素(细粒级)
4.SephadexG200

(二)操作方法
1.取一定量的血清,加等量的生理盐水,然后逐渐滴加饱和硫酸铵溶液,使成40%的饱和度,静置30min。
2.10 000r/min离心10min,去上清。
3.加入一定量的生理盐水,使沉淀溶解,再加入饱和硫酸铵溶液,使成40%饱和度。10 000r/min离心10min,去上清。
4.再重复步骤3一次。
5.将沉淀以少量生理盐水溶解,透析,除盐浓缩。
6.制备DEAE-纤维素柱,以0.005Mol/L pH8.0PB液平衡。
同时制备SephadexG200凝胶柱,以0.01Mol/L pH8.0PBS液平衡并进行洗脱。
7.以0.005Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白液为IgG。
7. 以0.025 Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白主要是IgE,再过SephadexG200凝胶柱,收集第一峰即为纯IgE。
8. 以0.035 Mol/L pH8.0PB液洗脱,得蛋白主要是IgA,再过SephadexG200凝胶柱,收集第一峰即为纯IgA。
10.以0.10Mol/L pH5.8PB液洗脱,洗脱液主要有IgM、IgG及白蛋白的混杂物。
11.以0.40Mol/L pH5.2PB液洗脱,得蛋白液主要是IgM。过SephadexG200,收
集第二峰即为纯IgM。

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