蛋白质组学

免疫组化问题及解决办法

如何实现完美的免疫组化实验

1、染色过强

原因

解决办法

抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度(一般指浓缩性抗体)抗体孵育时间:室温1小时或4℃过夜
孵育温度过高,孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃
DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟,以显微镜下观察为准

2、非特异性背景染色

原因

解决办法

操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5
组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭,孵育时间延长
组织中含内源性生物素 正常非免疫 动物血清再封闭
血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间

3、染色弱

原因

解决办法

抗体浓度过低,孵育时间过短 提高抗体浓度,孵育时间不能少于60分钟
试剂超过有效使用期 及时更换试剂
操作中,滴加试剂时缓冲液未沥干,致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(但防止切片干燥)
室温太低,低于15℃ 若室温低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟(或4℃冰箱过夜)
蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟

4、染色阴性

原因

解决办法

操作步骤错误 重新试验,设立阳性对照
组织中无抗原 设立阳性对照片,以验证实验结果
一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误

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