蛋白质组学

蛋白质组学常见问题与解答

Q:蛋白质组学有什么用,能给我实验带来什么?
可以大规模鉴定特定组织、细胞等各种样本的蛋白质种类、修饰状态以及蛋白质之间的相互作用,以及对这些蛋白质功能分析、分类;

可以对不同条件下某一特定样本进行大规模的蛋白质(包括翻译后修饰蛋白)表达量变化分析,筛选潜在biomarker,筛选重要信号通路;

依托大样本量,可以实现疾病的分子分型分析、重要潜在靶标鉴定。

Q:质谱的蛋白质组学和芯片哪个更好出结果?
两种方法侧重点不同,基于质谱的蛋白质组学技术一般是用来做高通量发现、筛选潜在biomarker、蛋白互作研究、大规模翻译后修饰水平研究;基于芯片的方法往往是大规模研究或验证已知蛋白蛋,做定量分析、蛋白互作分析等。前者属于无目的性的研究所有蛋白,然后筛选感兴趣蛋白。后者属于已经知道感兴趣蛋白,然后做进一步研究。

Q:蛋白质组学中检索时的数据库选择标准是什么?
若有对应物种的全基因组并有预测的全蛋白序列库,可优先选择全蛋白序列库;若无全蛋白序列库,有对应物种对应组织(器官等)的转录组测序结果并,可以使用转录组的测序结果(mRNA三框翻译或者预测CDS,并翻译成氨基酸序列);若基因组、转录组数据库都没有,优先选择同源性最接近的物种的全蛋白数据库,若近源物种没有合适的全蛋白库,则选择更大的蛋白全库(如动物全库、绿色植物全库、微生物库等)。

Q:物种没有测序,能否做蛋白质组呢?
因为当前大量的物种已经测序,预测了相应的基因,未测序的物种可以通过近缘物种的基因序列作为数据库进行蛋白质组的研究。因此,一般来说,未测序物种可以考虑近缘物种的基因组序列作为数据库,可以做蛋白质组。

Q:IP类样品的鉴定,若质谱未鉴定到目标蛋白,是什么原因导致?该怎么办?
因抗体质量问题,IP实验本身存在假阳性,此种情况质谱能检测到目标蛋白的概率较低;若IP实验没问题,但质谱未鉴定到目标蛋白的可能原因有:① 目标蛋白与抗体结合不强,IP洗脱时因太过剧烈导致实际结合的目标蛋白非常少,达不到质谱要求的灵敏度;② 样品中存在高丰度污染蛋白,其信号覆盖了目标蛋白的信号,导致未能鉴定到。解决方案:调整IP实验,如更换抗体(不同厂家更换)、改变洗脱策略(由剧烈变缓和),实验过程严格控制操作环境,避免引入大量污染蛋白。

Q:生物学重复和技术重复的区别是什么?
生物学重复是指不同生物个体或者不同生物群体的样品之间进行地相同处理而进行的实验,而技术重复是指同一样品进行的多次相同实验。举例:对来自三只健康小鼠A、B、C的血清样品分别各进行一次双向电泳,这三次双向电泳就是生物学重复;而取其中一只小鼠的血清样品进行三次双向电泳,或者将三只小鼠的血清混合后的样品进行三次双向电泳,这三次实验就是技术重复。总结生物学重复的样品来自不同的个体或者是群体,重复之间样品不同;而技术重复的几次实验的样品完全相同,可以来自单一个体,也可以是多个个体的混合样品,但用于重复实验的样品完全一样。

Q:哪些技术需要进行重复实验,以及具体采用生物学重复还是技术重复来完成?
Label free需要进行三次重复,而iTRAQ、TMT一般也建议您做3次实验重复,如果实验方案后期设计了大量的验证实验如WB或ELISA等,最好做也能做两次重复;如果不进行重复实验后期的验证实验也少,在后期发表文章的时候结果可能会受到一些审稿人的质疑,从而影响文章的发表,特别是一些高分杂志较为突出。

如果是进行技术重复,各实验结果之间的数据重复性会更好,而生物学重复由于多种原因可能导致重复性与偏差或者不好,一般情况下Label free最好使用技术重复,这样有利于后续数据的分析,而其他是实验可以采用生物学重复或者技术重复。代谢组根据样品的不同选择合适的数量进行生物学重复。

Q:能够对样品间的重复性做相关保证吗?如保证皮尔森相关系数都能达到0.8以上?
由于生物学样本,本身之间就具有个体差异,我们不能保证任何两者的比值的皮尔森相关系数都能达到0.8以上,但保证结果质量符合一般杂志要求。

Q:全谱分析和定量分析分别能鉴定到多少蛋白?
全谱分析和定量分析它们分别能鉴定到的蛋白数,跟样品的复杂度和样品制备方法有较大关系。一般情况下,常规样本全谱分析能鉴定到1000~3000个蛋白,定量蛋白质组学能鉴定到2000~6000个蛋白。

Q:组学后面怎么验证?验证的结果与组学结果不一致怎么办?
验证方法包括WB、IHC、q-PRC,以及基于质谱的PRM等。不一致时,首先考验证方法、操作是否有问题(可重复做);还可以考虑换其他验证方法;实在不行,需要考虑组学定量结果可能存在假阳性,需要重现筛选差异靶点。

Q:如何来判定哪些蛋白是和自己研究相关的蛋白,应挑选什么样的蛋白来进行后期的验证实验?
需要研究人员根据自己研究的相关生物学背景,再结合生物信息学分析的结果,以及查看相关的文献资料来确认哪些蛋白可以用于后续深入的研究。

Q:蛋白质组结果一般需要做哪些方面的生物信息学分析?
目前一般文献中的分析主要为维恩图分析、热图分析、火山图分析、层次聚类分析、蛋白质功能分析(GO分类为主)、蛋白质所属代谢通路富集分析(基于KEGG的pathway)、差异蛋白互作网络构建、转录因子预测等方面。

其它一些比较特异的高级分析包括多组数据关联分析、多pathway延伸分析、磷酸蛋白激酶预测分析、互作网络及生物调控模型构建分析。

Q:蛋白组学实验文章一般可发表哪些期刊上?
常见期刊包括有MCP (molecular & cellular proteomics), JPR(journal of proteome research), Proteomics, Journal of Prteomics, Electrophoresis, Plos One, BMC Genomics, Expert Rev Proteomics, BMC Syst Biol, OMICS, Proteomics Clin Appl, Proteome Sci等。

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本文由 生物在线 作者:阿拉丁 发表,转载请注明来源!

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