蛋白质组学

新发现-APEX新探针底物Alk-Ph可用于活体酵母细胞中蛋白邻近标记

 

今日关键词:APEX探针底物
抗坏血酸过氧化物酶(APEX)是一种功能强大的工具,可对活细胞中的蛋白质和RNA进行邻近标记。尽管APEX在哺乳动物细胞中得到了广泛使用,但由于传统的生物素-苯酚(BP)底物的标记效率低,限制了微生物领域中的APEX应用。酵母是研究真核细胞生物学的强大模式生物。蛋白质组学 由于BP底物的细胞渗透性差,APEX标记在酵母中并未获得成功。
重点来喽~科研人员开发出新的APEX探针底物,并且利用定量蛋白质组和转录组学数据证明了该探针具有良好的空间特异性和更高的覆盖度。
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2020年5月29日,北京大学化学邹鹏课题组与国家蛋白质中心杨靖课题组合作成功合成新一代应用于微生物体系的APEX探针底物—炔基苯酚(Alkyne-Phenol,Alk-Ph)。糖基化蛋白质组学 该研究成果发表在Cell Chemical Biology上题为“A Clickable APEX Probe for Proximity-Dependent Proteomic Profiling in Yeast”。新探针工具Alk-Ph实现了对活体酵母细胞中空间特异性蛋白质组的标记与高通量鉴定,与传统底物BP相比其细胞壁更具渗透性,可以显著提高完整酵母细胞中APEX的标记效率。多组学联合分析

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技术路线
结果速递
APEX底物Alk-Ph用于酵母中的亚细胞蛋白质组学分析
研究人员利用炔基代替生物素部分,发展了一种具有良好细胞壁通透性能的新探针—炔基-苯酚(Alk-Ph),在活细胞中进行标记后,带有探针的靶蛋白可通过点击化学反应连接上生物素或荧光基团,以便后续的富集或可视化(图1A)。
接下来借助定量蛋白质组学技术通过同位素二甲基标记策略来测定样品之间蛋白质丰度(图2B),分别在±APEX2和±probe的两个生物学重复样本中鉴定出705个和366个蛋白质(图3C),作者进一步通过ROC分析发现有150个线粒体基质蛋白富集,其中包括142个有线粒体注释的蛋白质,其余八个可能是线粒体定位有误或是非特异性结合(图3D)。
蛋白质组学图1:APEX2介导的标记蛋白质组学在酵母线粒体中的应用

LC-MS/MS鉴定标记肽段上的Alk-Ph修饰位点
尽管上述MS定量分析已证明在酵母中用Alk-Ph标记APEX2介导的蛋白质具有较高的空间特异性,但仍不可避免地受到非特异性蛋白质吸附的影响。因而作者利用MS直接鉴定Alk-Ph修饰的肽,该肽可以明确分配标记的蛋白质/位点。用带有可紫外线裂解的苯甲酸酯连接的生物素(Az-UV-生物素)点击肽,富集生物素标记肽后通过紫外线照射进行光还原,然后利用LC-MS/MS鉴定肽序列和Alk-Ph修饰位点(图2A),结果共鉴定了56个蛋白质(≥两个独有Alk-Ph修饰肽),结合之前蛋白结果共鉴定到酵母线粒体基质中165个蛋白质,特异性高达94%,覆盖度较APEX2 BP方法高达两倍以上(图2C、D、E)。
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图2:APEX2标记的位点鉴定及酵母线粒体基质蛋白质组分析
Alk-Ph探针可用于酵母中RNA邻近标记
鉴于Alk-Ph探针较高的标记效率,作者推测也可用于酵母中的RNA邻近标记。分别用Alk-Ph和BP标记表达Su9-APEX2的酵母细胞(图3A)。三种线粒体mRNA(MT-COX1,MT-ATP9,MT-ATP6)和线粒体rRNA(MT-21S rRNA)为阳性标记,两个丰富的胞浆mRNA(ACT1和TDH3)作为阴性标记。qPCR定量分析结果显示Alk-Ph标记的样品中四个阳性标记RNA的大量富集,而BP标记的样品中未观察到阳性标记RNA的大量富集(图3B)。

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图3:APEX2介导的Alk-Ph 标记线粒体转录组
结论
研究人员实现了活酵母细胞中使用Alk-Ph对蛋白质和RNA进行邻近标记,将邻近标记策略推广至微生物学领域,并利用定量蛋白质组和转录组学数据证明了该探针具有良好的空间特异性和更高的覆盖度。同时Alk-Ph探针还能揭示APEX在蛋白上的修饰位点,有助于分析膜蛋白的跨膜拓扑结构。
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可点击的 APEX 探针用于酵母蛋白质组的邻近依赖性研究
期刊名称:Cell Chemical Biology
IF:7.739
样本选择:酵母细胞
取样策略:Su9-APEX2(无Alk-Ph,轻标,n=2),Su9-APEX2(Alk-Ph,重标,n=2),Su9-eGFP(Alk-Ph,轻标,n=2)
技术策略:标记蛋白质组学,实时定量PCR

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