蛋白质组学

甜蜜的负担——O-GlcNAc

蛋白质的糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰,是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。研究表明70%人类蛋白包含一个或多个糖链1%的人类基因组参与了糖链的合成和修饰。

哺乳动物中蛋白质的糖基化类型主要可分为两种:N-糖基化和O-糖基化。而O-糖基化位点没有保守序列,糖链也没有固定的核心结构,组成既可以是一个单糖,也可以是巨大的磺酸化多糖,因此与N-糖基化相比,O-糖基化分析会更加复杂。

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2021年3月3日,裴华东团队、秦伟捷团队以及贺福初院士团队等合作在Molecular Cell杂志上在线发表了题为“Posttranscriptional Regulation of De Novo Lipogenesis by Glucose-Induced O-GlcNAcylation”的研究论文。该研究报道了O-GlcNAc修饰通过增强SRPK2的细胞核内定位、在转录后水平上调控肿瘤细胞的脂质从头合成水平、进而促进肿瘤生长的新机制;这一调控依赖于importin α/β入核转运系统,且进一步研究提示importin α蛋白可能是O-GlcNAc修饰的“reader”。

 

很多研究表明,O-GlcNAc糖基化参与调控细胞转录、信号转导以及应激反应等多个生物学过程,与神经退行性疾病、糖尿病以及癌症等人类重要疾病相关。O-GlcNAc糖基化修饰能感应细胞外的葡萄糖、脂肪酸等其他能量分子的水平,被人们视为一种潜在的“营养感受器”,近期研究也表明O-GlcNAc糖基化有可能积极的直接参与调控细胞代谢过程。在癌症中,O-GlcNAc糖基化水平明显升高,异常的O-GlcNAc跟癌细胞的增殖、侵袭以及转移有关系。

 

 

 

 

结果速递

 

 

HBP在转录后水平上影响新生脂肪形成

HBP(己糖胺生物合成途径)是糖酵解的一个分支,负责生成UDP-GlcNAc,UDP-GlcNAc是蛋白O-GlcNAc修饰形成所需的糖基供体。为了研究HBP是否调节新生脂肪形成,研究人员通过在MCF7细胞中敲低HBP途径中的限速酶谷氨酰胺-果糖6-磷酸转氨酶1(GFPT1),证明了敲低GFPT1可以降低细胞中UDP-GlcNAc的含量。此外,通过在培养基中添加UDP-GlcNAc发现可恢复新生脂质的合成。这些研究证实了O-GlcNAc修饰可以调控细胞内脂质从头合成水平以及相关基因mRNA的剪接、稳定性与表达水平。

图1.HBP在转录后水平上影响新生脂肪形成

 

OGT介导O-GlcNAcylation,核易位和SRPK2激活

有研究表明SRPK2可以促进脂肪生成基因mRNA的稳定性和新生脂肪生成。因此,研究人员检查了HBP是否通过SRPK2影响新生脂肪形成。通过CRISPR-Cas9技术生成了SRPK2敲除细胞,并比较了有无OGT敲除情况下这些细胞的新生脂肪生成。正如预期的那样,SRPK2 KO MCF7细胞的新生脂肪形成受到损害,当OGT也被敲除时,这种损伤在这些细胞中也相似。研究表明,SRPK2和OGT在促进脂肪生成的途径相同,但OGT通过影响SRPK2丰度的其他机制调节SRPK2。并且通过LC-MS / MS分析发现了S490、T492和T498是SRPK2上的主要O-GlcNAcylation位点。

图2.OGT O-GlcNAcylates SRPK2并促进其核易位和激活

 

SRPK2 O-GlcNAcylation在核定位信号处诱导其与importin α/β的结合和核易位

在细胞中,importin α/β系统是调控蛋白入核的经典途径,其中importin α蛋白的N端可以结合importin β蛋白,C端可以结合货物蛋白的核定位序列(Nuclear-localization signal, NLS),从而形成三元复合物通过核孔将蛋白运入细胞核内。为了确认importin α结合SRPK2的O-GlcNAcylated NLS,研究人员合成了SRPK2 487至523残基的肽。这些肽包含NLS和O-GlcNAcylation位点S490、T492和T498。通过在体外修饰这些肽以产生O-GlcNAcylated或未修饰的肽。使用表面等离子体共振(SPR)分析,确认了O-GlcNAcylated肽和importin α3之间的直接相互作用,但未修饰的肽与importin α3之间没有直接的相互作用(图4G)。这些结果表明O-GlcNAc修饰可以显著增强SRPK2与importin α蛋白的相互作用,表明importin α可能是O-GlcNAc修饰的“reader”。

图3.NLS处的SRPK2 O-GlcNAcylation诱导其与importin α/β的结合

 

OGT-SRPK2途径与mTOR信号传导途径平行

之后,考虑到前人报道的mTORC1/S6K1介导的SRPK2的磷酸化修饰位点与鉴定到的糖基化位点相近,那么其与糖基化修饰之间是否存在相互影响呢?实验表明,SRPK2糖基化修饰存在与否并不影响SRPK2 S494位点的磷酸化修饰。雷帕霉素是mTOR的抑制剂。在雷帕霉素处理的条件下,SRPK2糖基化修饰仍然能够响应外界葡萄糖浓度的变化,进一步调控脂质的从头合成水平。这些结果都提示了OGT介导的SRPK2 O-GlcNAcylation与mTORC1/S6K1通路是平行的。为了评估SRPK2 O-GlcNAcylation的病理作用,基于体内体外实验证明了SRPK2糖基化修饰可以促进乳腺癌细胞的生长与增殖。

图4.OGT-SRPK2途径与mTOR信号传导途径平行

 

O-GlcNAcylation促进货物蛋白与importin α结合并实现蛋白质的核输入

最后,研究人员结合自有数据和已发表的数据库信息,发现来自人类和小鼠的353种蛋白质在NLS里面或附近都存在O-GlcNAcylation位点。这些蛋白质参与多种关键的细胞过程,例如基因转录、蛋白质修饰和细胞凋亡等。从这些蛋白中,研究人员挑选了RELA与Sp1进行了基于COIP和pulldown的实验验证,结果证实了这些蛋白的糖基化修饰可以显著增强其与相应importin α蛋白的相互作用,进而促进其在细胞核内的定位。

 

小结

总的来说,该研究一方面建立了O-GlcNAc修饰的实验流程和质谱解析方法,为其他领域的O糖基化研究提供了方法学借鉴;同时揭示了O-GlcNAc修饰在转录后水平上调控肿瘤细胞脂质从头合成与促进肿瘤生长的分子机制,且OGT-SRPK2通路平行于mTORC1-S6K1-SRPK2通路,提示OGT与mTORC1通路抑制剂的联合使用可能对于相关肿瘤的治疗具有更好的效果。

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期刊名称:Molecular Cell

IF:15.584

样本选择:MCF7和HEK293T细胞系,小鼠模型

技术策略:糖基化蛋白质组学、代谢组学、全转录组测序等

 

 

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