蛋白质组学

冷冻电镜样本制备新技术在新冠病毒结构解析的应用

前言

近日,由新型冠状病毒引起的肺炎疾病在武汉和全国各地都形成了一定规模的爆发,已经引起了中国甚至全球的高度重视,那么这个冠状病毒究竟是什么?

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae),是具外套膜(envelope) 的正链单股RNA病毒,直径约80~120nm。冠状病毒可以引起中东呼吸综合征、严重急性呼吸综合征以及目前正在爆发的新型肺炎。近日,国家病原微生物资源库发布了由中国疾控制中心病毒预防控制所成功分离的我国第一株病毒的电镜照片。 

下图中(电子显微镜下的新型冠状病毒武汉株01),黑色箭头所示就是新型冠状病毒,可以看出,病毒的大小约为100纳米。

 

解析冠状病毒结构,助力疫苗和药物研发

目前,我们已知新型冠状病毒是RNA病毒,它的蛋白结构序列还没有确定出来,在分离完毒株之后,则要用冷冻电镜来全面解析病毒的三维结构,从而为开发疫苗和相关的药物奠定基础。2019年,中国科学家利用冷冻电镜技术解析到世界上目前分辨率最高的猪瘟病毒结构,这对我们了解该病毒的发病机理,以及如何更好地开发疫苗至关重要。在这个特殊的时期,尽快加速新冠病毒的结构解析同样意义重大,有助于研发出更多更好的抗新型肺炎药物。

我国科学家解析出的非洲猪瘟病毒结构示意图

最近,上海科技大学和中科院上海药物所联合团队预先公布抗冠状病毒最关键的蛋白之一,3CL水解酶的高分辨率晶体结构,并已迅速发现了30种可能对新型冠状病毒有治疗作用的药物、活性天然产物和中药。在这个过程中,冷冻电镜技术是获得高分辨率的冠状病毒三维结构的最佳手段。那么,冷冻电镜是何物?

冷冻电镜技术: 结构生物学的革命性突破
 

冷冻电镜技术(Cryo-EM)的基本原理是将生物大分子溶液置于电镜载网上形成一层非常薄的水膜,然后利用快速冷冻技术如置于液态乙烷使其形成玻璃态的冰,生物大分子就被固定在这层薄冰里。将这样的冷冻样品保持低温放置在透射电子显微镜下观察,从而获得生物大分子原子分辨率的三维空间结构,被称为冷冻电镜技术。冷冻电镜的出现,突破了传统方法如X射线晶体衍射和核磁共振的技术局限,使得解析高分辨率生物大分子复合物的三维结构变得更为容易和常规。
 

英国剑桥MRC实验室人员在操作冷冻电镜
 

近年来,越来越多蛋白质或复合蛋白质结构解析领域被称为诺贝尔奖级别的论文陆续发表,背后的利器正是冷冻电镜。2015年,《自然》杂质旗下的子刊nature method将冷冻电镜技术评为年度最受关注技术。在过去几年里,冷冻电子显微镜技术逐渐成为结构生物学的重要研究工具。冷冻电镜技术的三位先驱者,也凭借对冷冻电镜技术的开拓和持续推进,获得了2017年的诺贝尔化学奖,以表彰他们在冷冻电子显微镜技术上的杰出贡献,使电子显微镜在高真空环境下观察接近生理状态下的蛋白成为可能。
 

2017 年诺贝尔化学奖三位获奖者

冷冻电镜关键步骤:样本制备
 

冷冻电镜技术关键步骤是制备高质量的的样本,即如何保证样品分子颗粒均一的分布在厚度恰当的玻璃态冰层中决定着实验结果的成败。现有冷冻样本的样本制备流程如下:

 

把载有样品如缓冲液中的病毒、蛋白质和 DNA 组装颗粒等的电镜载网快速投入经液氮冷却的液态乙烷中,在载网孔或支持膜上形成约十几到过百纳米的玻璃态薄冰, 样品颗粒则被分散包埋在其中而形成冷冻样品。薄层水玻璃化法简单快速, 适用于单颗粒生物样品的研究, 此制样技术被广泛用于病毒、大分子及其复合体的研究。
 

冷冻电镜样本制备流程示意图

 

现有冷冻电镜样本制备技术的缺陷

然而,传统冷冻电镜样本制备方法存在缺陷:

1. 以手工或半自动设备,操作复杂,依赖较高的技巧
 

 

2. 采用blot方式,大量样品被浪费在滤纸
 

3. 实验的稳定性和可重复性较差
 

4. 样品存放的可追溯性差,容易导致样品丢失
 


 

      总体而言,冷冻电镜的样品制备技术的不成熟已经成为限制冷冻电镜技术发展的关键性因素。为了解决这个核心问题,来自于英国SPT Labtech公司 (前身为TTP Labtech,其核心产品mosquito 在蛋白结晶筛选领域家喻户晓) 最新研发了一款全自动冷冻电镜样本制备系统: 变色龙(chameleon),致力于解决目前样本制备过程存在的上述种种问题。(变色龙:新一代冷冻电镜全自动样本制备系统
 


变色龙 - 带来冷冻电镜样本制备技术的革命性突破:全自动,blot free

变色龙在样品制备中有以下特色:

1. 整个过程全自动,包括grid的夹取,点样,拍照等操作,无人为干预,确保实验的可重复性。

 

2. Blot-free:告别使用滤纸blot的时代。变色龙采用独特的self-wicking 碳膜铜网,通过内部纳米铜纤维的毛细作用,帮助样品在短时间内迅速形成薄膜层。
 


 

3. 样品使用量低:通过分液探头,可将样品快速喷至grid铜网上,最低仅需6 nL。
 


 

4.  快速plunge time:从喷点样品至铜网上到置于液态乙烷进行快速冷冻,最快仅需54 毫秒,避免较长暴露在空气中可能导致的样品构象排列的倾向性。
 


 

5.  借助独有的图像算法软件,在正式电镜实验前,提前获得最优化的冰层范围以及相应的plunge time。
 


 

6. 专门设计的成像和软件系统,追溯每个参数和实验细节。
 

 

结束语
 

国内冷冻电镜应用领域的领军人物,中国科学院院士、结构生物学家、西湖大学校长施一公曾表示,冷冻电镜的发展像是一场猛烈的革命。“就目前发展前景来看,冷冻电镜技术是可与测序技术、质谱技术相提并论的第三大技术!” 冷冻电镜技术的突破给结构生物学领域带来了一场大风暴,大量高分辨率的分子机器、膜蛋白、蛋白质复合物结构被报道,相关领域的研究也迈进了一个崭新的时代。
 

作为冷冻电镜关键的前序步骤: 样本制备,新一代冷冻电镜全自动样本制备系统“变色龙”的出现,致力于改变现有传统技术的种种缺陷,以期帮助科学家更加稳定、高效地获得高质量的冷冻电镜样本。

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