蛋白质组学

Ella Simple ELisa检测技术在宿主细胞蛋白质(HCP)残留的应用

宿主细胞蛋白质(HCP)残留,是重组治疗性蛋白质、重组疫苗及重组抗体药物工艺过程中产生的宿主细胞蛋白质及其修饰体。

HCP残留是工艺稳定性监测的重要评价指标,是重组疫苗及重组抗体类药物的重要质控指标,ELISA法是各国药典推荐方法。美国FDA推荐值:1-100ppm(ppm:百万分之一),中国药典重组疫苗个论,CHO细胞HCP小于0.05%(相当于小于500ppm)。

--HCP的来源--

与宿主细胞相关

  • 宿主细胞产生的与先天免疫(Toll样受体)相关的鞭毛蛋白

Toll样受体(TLR)是先天免疫系统的一部分,在哺乳动物之间高度保守。它们已进化为对外来病原体,尤其是细菌,提供一线反应,产生免疫应答。鞭毛蛋白(一种常见的蛋白质)大量存在于所有鞭毛细菌中,包括用于生产重组生物治疗药物的大肠杆菌之中。鞭毛蛋白具有较强的抗原性,可以与人类Toll样受体中的TLR5结合,启动免疫应答。因此,宿主细胞产生的HCP如鞭毛蛋白,可作为免疫原刺激机体产生抗HCP抗体,所以需在质量控制时进行监控(因触发TLR可能引起败血性休克)。

  • 宿主细胞产生的酶类

宿主细胞产生的活性酶,例如组织蛋白酶D,可以与mAb中的特定序列结合,从而使抗体降解。其它由宿主细胞产生的溶酶体磷脂酶A2和纤维素酶可以直接影响赋形剂的稳定性,从而影响产品制剂的稳定性。

  • 宿主细胞产生的细胞因子杂质

细胞因子是一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应,调控免疫应答。高度保守的细胞因子,也可在宿主细胞中表达。如宿主细胞中产生的细胞因子,如MCP-1或TGF-β1,在产品纯化中未能达到很好监控,则临床上易发生患者组胺释放等不良反应事件。

与产品相关

  • 宿主细胞产生产品的同源物

宿主细胞产生与产品同源的HCP产物,例如在对早期生物药物之一重组人组织纤溶酶原激活剂(tPA,Activase,Genentech)进行表征的过程中,观察到一个较小的变异。进一步的研究表明,这是从用于生产该产品的CHO细胞中共纯化仓鼠纤溶酶原激活剂(PA)。且两种蛋白之间存在大约80%的同源性。如果HCP是产品的同源物,并且可以在宿主细胞中表达,则会具有相似的色谱特性,从而实现共纯化。但在临床试验期间安全性数据表明,即使含有PA这种HCP,该药物总体上的风险水平是可接受的。但由于对于大多数治疗适应症(中风,心肌梗塞,肺栓塞)的患者,tPA是单次静脉注射,因此容易导致杂质的免疫原性。

  • 宿主细胞产生产品靶点的同源物

如果宿主细胞产生的人源化或人单克隆抗体(mAb)可以与目标蛋白的仓鼠同源物发生反应,那么这种HCP会将通过纯化系统进行携带。例如AntigenA是一种与目标疾病有关的肽,它在物种之间是高度保守的,因此会在CHO系统表达。当mAb与AntigenA特异性结合后,mAb会将此类蛋白质带入最终产物。虽然此类HCP可以通过下游处理在某种程度上清除。尽管如此,生物制药生产商应了解其靶蛋白的宿主细胞同源物,并设计纯化和控制系统来解决此问题。

  • 宿主细胞产生与产品非特异性结合的HCP

宿主细胞产生的HCP也可以与mAb进行非特异性的结合,虽然大多数HCP可以在早期的纯化步骤中除去,但是一些“搭便车抗原”仍然会躲过常规的Elisa的HCP检测。例如,磷脂酶B样2(PLBL2)可以与人源化mAb结合,特别是与IgG4同种型的单克隆抗体结合,并且在一些广泛使用的抗CHOP免疫测定中未检测到。但在临床监控时发现,局部注射部位显示出潜在的免疫原性。且在患者体内,抗PLBL2抗体滴度都有显着增加,并且随着治疗时间的延长而进一步增加。因此在Lebrikizumab的后续的生产工艺中,加大了对PLBL2杂质的去除。
--HCP带来的影响--

免疫原性

HCP在患者中可能具有直接的生物学活性,例如触发Toll-Like受体介导的先天免疫反应,或者直接由宿主细胞产生的细胞因子刺激机体,产生组胺,发生炎症反应。对于一些与产品非特异性结合的HCP,则可直接在机体内产生抗体,增加病人体内的抗体滴度。

佐剂效应

HCP可以是免疫原性的,直接引发针对特定HCP杂质的抗体。但同时也可以作为佐剂,从而增加机体对治疗蛋白的免疫反应,及产生抗抗体“ADA”,从而直接影响药物在生物分布,药代动力学和生物活性。

产品稳定性

HCP杂质同样会影响产品的稳定性,从而影响生物药物的使用。例如宿主细胞产生的蛋白酶,直接与某些抗体的降解有关。也有研究报道,一些由CHO或大肠杆菌衍生的HCP可以影响赋形剂聚山梨酯20和聚山梨酯80的稳定性,从而影响药物的储存。

--CHO HCP的检测方法--

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被广泛用于生产治疗性蛋白质。在这些蛋白质的生产过程中,宿主细胞表达系统产生的宿主细胞蛋白质(HCP),被作为来自过程中的相关杂质而被共纯化,对接受治疗性蛋白的患者造成潜在的免疫原性风险。因此,在生物制药药物开发中,需要监测与过程相关的HCP的含量。监管机构要求最终药品中的HCP含量必须小于100 ppm,但仍需药物生产企业开发方法以量化IP(in-process)和最终原料药DS(drug substance)中的HCP含量,以证明HCP清除率。

ELISA是在1970年代开发的,利用抗体在96或384孔微孔板中定量感兴趣的特定抗原。 ELISA有多种类型,例如直接,间接,三明治和竞争性ELISA。在所有类型中,检测都取决于抗体和抗原的结合方式。通常,双抗体夹心ELISA用于定量HCP。

但是,传统Elisa检测HCP具有以下缺点:

  • 多次手动操作(即缓冲液,洗涤步骤,抗体和抗原添加,样品添加,孵育步骤);

  • 需要优化缓冲液,以使“捕获”抗体与微孔板的连接稳定。否则,它将无法捕获样品,从而导致检测和比色响应不足;

  • 试剂孵育长或短时间可能导致假阳性或假阴性结果,因此需要考虑板的显影时间;

  • 操作时间长,一般为5-7小时;

  • 样品上样量大,需要100-200μl。

--Ella CHO HCP检测--

Ella CHO HCP 3G使用微流体代替板清洗和加载步骤来测量抗原浓度(图1A)。所有实验性免疫测定步骤均在精心设计的带有三个单独的玻璃纳米反应器(GNR)的单个通道中进行。捕获抗体固定在GNR上,而抗原样品和检测抗体(生物素化抗体和SA-dyelite650)都从特定的入口通道流到GNR(图1B)。

全程Ella分析只需三个步骤

  1. 向孔中添加25μl样品;

  2. 将Cartridge放入Ella仪器中进行全自动的样品上样;

  3. Ella自动抗体孵育及检测。

在每个实验运行结束时,每个样品有三个单独的数据点,分别对应于每个孔中的三个GNR。所有孵育均在一个步骤中进行(传统ELISA需对单个样品数据点有多种操作)。此外,可以将标准曲线以“条形码”的形式内置到Ella里,无需再做标准曲线。

Ella CHO HCPElisa检测HCP清除率的可比性研究

Ella CHO HCPElisa检测多个抗体HCP的精密度的可比性研究

Ella CHO HCPElisa检测多个抗体HCP的准确性的可比性研究

总结:

Ella CHO HCP检测可以在IP开发为DS期间,加快对CHO HCP杂质进行与开发相关决策的速度。Ella的软件支持GMP,并且可以在GMP实验室中建立。Ella只需75分钟的分析时间,可以加速药品的批量释放。此外,Ella还拥有多因子检测的能力,可以将CHO HCP和这些共纯化的HCP(具有免疫原性或稳定风险的酶类)都可以在一个测定板上同时进行分析。

参考文献: Experience with Host Cell Protein Impurities in Biopharmaceuticals,Biotechnol Prog. 2018 Jul;34(4):828-837.

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