蛋白质组学

蛋白质含量测定的操作方法

 
衡量食品的营养成分时,要测定蛋白质含量,但由于蛋白质组成及其性质的复杂性,在食品分析中,通常用食品的总氮量表示,蛋白质是食品含氮物质的主要形式,每一蛋白质都有其恒定的含氮量,用实验方法求得某样品中的含氮量后,通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。
 
一般食品蛋白质含氮量为l0%如肉、蛋、豌豆、玉米等,其换算系数为6.25,小麦取5.70,大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17,动物胶5.55。
 
一、目的与要求:
 
掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消化,蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。
 
二、原理:
 
凯氏定氮法:食品经加硫酸消化使蛋白质分解,其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸液吸收后,再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量,再乘以一定的数值即为蛋白含量,其化学反应式如下。
 
(1)  2NH2(CH2)2COOH+13H2S04    (NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2
 
(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4
 
(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O
 
(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2
 
三、试剂与仪器:
 
1、硫酸钾
 
2、硫酸铜   
 
3、硫酸
 
4、2%硼酸溶液
 
5、40%氢氧化钠溶液
 
6、混合指示剂:把溶解于95%乙醇的0.l%溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95%乙醇的0.l%甲基红溶液2毫升混合而成.
 
7、0.OINHCL标准溶液或0.01N硫酸标准溶液.
 
8、凯氏微量定氮仪一套。
 
9、定氮瓶100m1或50ml一只。
 
10、三角瓶150ml 3只。
 
11、量筒50ml、lOml、lOOml。
 
12、吸量管10ml只。
 
13、酸式滴定管1支。
 
14、容量瓶100毫升1只。
 
15、小漏斗1只。
 
四、操作方法:
 
1、  样品处理:精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品(约相当氮30-40mg),移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中,加入0.2g硫酸铜,3g硫酸钾及20毫升硫酸,稍摇匀后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上,小火加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5小时。取下放冷,小心加20ml水,放冷后,移入100ml容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。
 
2、  按图装好定氮装置,于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入数粒玻璃珠以防暴沸,用调压器控制,加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
 
3、  想接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴,并使冷凝管的下端插入液面下,吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室,并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内,塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯,提起玻璃塞使其缓慢流入反应室,立即将玻璃盖塞紧,并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹,开始蒸馏,蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内,蒸馏5min。移动接收瓶,使冷凝管下端离开液皿,再蒸馏1min,然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶,以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
 
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
 
计算:
 
X =((V1-V2)*N*0.014)/( m*(10/100)) +F*100 
 
X:样品中蛋白质的含量,g;
 
V1:样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积,ml;
 
V2:试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积,ml;
 
N:硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度;
 
0.014:1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数;
 
m:样品的质量(体积),g(ml);
 
F:氮换算为蛋白质的系数。
 
注:
 
(1)样品应是均匀的,固体样品应预先研细混匀,液体样品应振摇或搅拌均匀。
 
(2)样品放入定氮瓶内时,不要沾附颈上,万一沾附可用少量水冲下,以免被检样消化不完全,结果偏低。
 
(3) 消化时如不容易呈透明溶液,可将定氮瓶放冷后,慢慢加入30%过氧化氢2-3ml,促使氧化。
 
(4)在整个消化过程中,不要用强火,保持和缓的沸腾,使火力集中在凯氏瓶底部,以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。
 
(5)如硫酸缺少,过多的硫酸钾会引起氨的损失,这样会形成硫酸氢钾,而不与氨作用,因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时,要增加硫酸的量。
 
(6)加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点,硫酸铜为催化剂,硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
 
(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿,可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
 
(8)氨是否完全蒸馏出来,可用PH试纸试馏出液是否为碱性。
 
(9)吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸,过剩的酸液用0.01N碱液滴定,计算时,A为试剂空白消耗碱液数,B为样品消耗碱液数,N为碱液浓度,其余均相同。
 
(10)以硼酸为氨的吸收液,可省去标定碱液的操作,且硼酸的体积要求并不严格,亦可免去用移液管,操作比较简便。
 
(11)向蒸馏瓶中加入浓碱时,往往出现褐色沉淀物,这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应,生成氢氧化铜,经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用,生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++

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