蛋白质组学

看MRC的科学家如何快速、直接进行大分子结晶条件优化

简介
 
X-ray晶体学方法是目前获得生物大分子结构的最有效手段。但是想要从纯化的蛋白、核酸或是大分子复合物获得晶体需要面临巨大的挑战。与繁复冗长的实验设置和过程相伴的往往是极低的实验成功率。首先,研究者会用购买商品化的试剂盒,在一个广泛的范围内对纯化的样品进行一轮结晶条件的初步筛选。然后,再根据具体的实验情况进行一轮优化筛选,以便重复和改善初步筛选时获得的结果。通过优化的条件,得到高质量的晶体,就可以获得可靠的X-ray衍射数据,从何解析出高分辨率的结构。
 
通常,优化筛选使用传统的液体加样器,由手工来完成。整个过程会非常地耗时。另外,常用的储液含有低表面张力或是高粘度的组份,如PEGs。这些因素经常会导致加样不准确和交叉污染的发生。
 
MRC分子生物学实验室的科学家使用英国TTP Labtech全新研发的全自动液体处理工作站—dragonfly,轻松克服了上述阻碍,全自动优化得到了三种不同蛋白质样本的结晶。这台创新型的仪器使用固相置换技术和非接触式加样原理,不仅可以杜绝交叉污染的发生,对所有类型的液体(包括极其粘稠的甘油)当加样精度达到1 μL级别时,CV值都控制在5%以内,确保准确加样。研究人员可以在任意一种SBS加样板中,快速简便地制备自己需要的筛选条件。一块包含96种筛选条件的加样板,可以在3-6分钟的时间内制备完成。
 
实验材料和方法
 
Lysosyme、Concanavalin A以及Catalase的蛋白样品按照报道的方法进行准备,并完成了初步筛选。
 
按照不同蛋白得到的初步筛选条件,沉淀剂(PEG)和添加剂(如:propanediol)的浓度以对角线梯度的方式升高或是降低,从而进一步优化筛选条件。这样的加样方式可以在结晶板内产生两种不同试剂的浓度梯度,每个孔内所需要添加的不同储液量都会自动依次分配。每种蛋白都会尝试3种不同的pH条件,用dragonfly准备9块含有不同筛选条件的加样板。
 
将这9块筛选板放在水平摇床上混匀,用mosquito直接进行蛋白溶液和筛选液的混合加样(100 nL + 100 nL)。每天进行培养观察,三周后获得了生长出的晶体照片。
 
结果
 
每块优化筛选板的准备时间都不超过4.5分钟。经过7天得培养,每块板中都可以观察到3到15个孔内有晶体生长。
 
晶体成核和生长的条件都通过调节溶液的浓度和pH值的方法进行优化。通过这种方式,获得了大量的单个大体积的晶体。结构解析和配体结合的研究过程中,往往会发生严重的晶体丢失的现象。大量晶体的获得可以克服这个研究的瓶颈。
 
小结
 
dragonfly已被证明可以快速有效地在96孔内完成结晶条件的制备工作。与传统的手工加样相比,dragonfly制备优化筛选条件的速度提高了至少3倍。
 
dragonfly采用的固相置换和非接触式加样技术确保了任意黏度液体的加样准确性,同时还杜绝了交叉污染的发生。仪器的设置和运行十分简单便捷,不需要复杂的培训就可以让不同的使用者独立进行实验操作。伴随着实验的成功,用dragonfly配制优化筛选条件已经成为了MRC分子生物学实验室进行进行筛选的日常实验手段。使MRC的科学家可以快速、直接进行大分子结晶条件优化。
 
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