蛋白质组学

Nicoya OpenSPR 在酶类研究中的创新应用

Nicoya OpenSPR 在酶类研究中的创新应用------β羧化β-碳酸酐酶结构对γ-碳酸酐酶结合的影响


 



碳酸酐酶CcaA是蓝藻细菌羧酶体的组成成分。CcaA含有特征性的未知功能的C末端延伸,通过与γ-碳酸酐酶(CcmM)的相互作用被整合到羧酶体上,在很多蓝藻细菌中CcmM是具有酶活性的碳酸酐酶的同源体。我们已经从集胞藻属中确定了CcaA的结构。与大多数细菌碳酸酐酶的二聚体结构或者植物酶中丢失的二聚体结构不同,CcaA展现很好的三聚体结构。



为了探索碳酸酐酶CcaA与γ-碳酸酐酶(CcmM)相互作用机制,2017年圭尔夫大学分子与细胞生物学系的Matthew S. Kimber团队在《BIOCHEMICAL  JOURNAL》发表了他们的研究成果,研究发现CcaA / CcmM复合物的形成可能需要至少在一个结合配对区移动的重要支柱。表面等离子共振技术表明CcaA与CcmM以亚皮摩尔的亲和力,通过CcmM's αA的螺旋区和CcaA's的C末端尾部形成复合物。催化特征表明,相对γ-碳酸酐酶CcmM,CcaA是至今为止最不活跃的β碳酸酐酶,其即可补充也可被替代。有趣的是,C末端尾部显示出部分的抑制活性,可能会减少未封装的酶的活性。



为了进一步研究CcaA / CcmM复合体形成机制,本次实验首先设计引物扩增CcaA274和CcaA220基因,之后插入PET 载体表达,之后通过加拿大Nicoya公司的OpenSPR仪器(LSPR技术)检测蛋白与蛋白的亲和力。为突出CcaA 的C末端尾部的作用,实验过程检测了CcaA274和CcaA220与CcmM206的结合情况,并以前两者作为配体固定到COOH芯片上,用标准的EDC和NHS激活芯片,CcaA浓度范围为15-50μg/mL,运行速度20μL/min,分析物浓度(CcmM206或CcmM206-4A; 0.12-29.9μg/mL),运行速度20-150μL/min;同时还调查了CcaA结构对CcmM206-4A(含Q159A/H161A/D168A/Q170A四个氨基酸的突变体)的结合影响,结果用TraceDrawer 软件分析,获取的 CcaA与CcmM的动力学结果如下表:



表1:CcaA与CcmM的结合常数,解离常数,亲和常数



表1:CcaA与CcmM的结合常数,解离常数,亲和常数


LSPR检测结果显示:CcaA274对CcmM206-4A 结构的亲和力降低了9倍,表明CcmM αA周围的冗余侧链通过CcmM在调节CcaA结合中起重要的作用,尽管这些单独的侧链不是必须的,并且CcaA220与CcmM206-4A的结构结合也变弱,而CcaA274与CcmM206的相互作用力很强。证明了CcmM-4A的结构对亲和力有很明显的影响作用。同时也证实CcmM的C末端β螺旋可能对相互作用起决定性作用。整个实验过程操作简单,检测速度非常快,获取的动力参数,科学客观的数据透彻的解析了CcmM末端β螺旋在与CcaA相互作用中的决定性作用。


Nicoya OpenSPR个人型分子互作仪优势:


操作简单---半个小时即可掌控


高检测效率---15-30min出结果


实验成本低---低成本仪器及芯片


• 低背景干扰--检测不受温度、缓冲液折射率影响


• 无需专门的校正通道---可忽略的bulk效应



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