蛋白质组学

一种针对细胞表面受体进行抗体筛选的多重分析方法[创新技巧]

    本文以人EGFR抗体与细胞表面EGFR抗原结合为例,描述TTP Labtech的mirrorball仪器作为一种“mix-and-read”方法在在抗体筛选中的应用。EGFR配体的蛋白家族参与了细胞迁移,粘附和分化等活动,包括乳腺癌,肺癌,结肠癌在内的许多疾病都和EGFR的过度表达有着密切的关系。

    不同靶蛋白的单克隆抗体的应用领域不断扩大,可以用于不同疾病的治疗和诊断(譬如癌症,自身免疫性疾病)。单克隆抗体是特定细胞系针对特定抗原的分泌到细胞培养基中的生物蛋白,而高通量筛选是抗体开发的重要组成部分。

ELISA和Mix-and-read

    利用传统ELISA技术在进行抗体筛选时有许多局限性,由于ELISA技术依赖于微孔板上包被的抗原,所以该方法不适合检测低溶解性的抗原(譬如细胞表面受体)。由于ELISA的操作方式,使得ELISA很难进行识别细胞表面抗原天然构象的抗体的筛选。即使对于可溶性抗原抗体筛选,由于微孔板对检测抗体的吸附从而改变蛋白构象,继而无法识别抗原特定抗原表位。

    一种“mix-and-read”分析方法在生物制药行业的单克隆抗体筛选领域得到广泛应用。这种”mix-and-read”分析方法是将所有分析组分加到一个孔中,继而孵育从而使得结合达到平衡。对于抗体筛选,该方法可以利用包被抗原的珠子或者表达抗原的细胞进行分析,抗原抗体的相互作用可以通过结合在珠子或者细胞的荧光标记的偶联物的荧光强度进行检测。结合的荧光可以利用细胞技术仪无需洗涤进行分析,以达到区分测试孔中结合和游离的荧光。Lee等在发明FMAT时,详细介绍了相比传统ELISA方法细胞计数仪的优势。相对于传统的ELISA分析方法,利用该技术分析“mix-and-read”实验可以提高检测的灵敏度和分析的通量,同时也提高抗体的识别和检测。

高速的多重分析

    TTP LabTech的mirrorball非常适合这种“mix-and-read”实验的分析,由于其灵敏度很高,从而可以检测低丰度表达的细胞膜蛋白。该仪器不仅能够快速进行单激光扫描,而且可以同时进行405,488,640nm激光扫描,因此可以进行多种荧光素的选择。其可以不依赖于激发光直接对发射荧光进行矫正的能力,从而在抗体筛选应用中可以对珠子和细胞进行多重分析。

    该文章中以人EGFR抗体与细胞表面EGFR抗原结合为例,描述TTP Labtech的mirrorball仪器作为一种“mix-and-read”方法在在抗体筛选中的应用。EGFR配体的蛋白家族参与了细胞迁移,粘附和分化等活动,包括乳腺癌,肺癌,结肠癌在内的许多疾病都和EGFR的过度表达有着密切的关系,因此抑制EGFR的表达和激活在治疗这些疾病过程中起着非常重要的作用。

    为了检测mirrorball的检测敏感性,该通讯利用两种高表达EGFR的上皮癌细胞系A549和A431进行检测不同浓度的抗EGFR受体与EGFR的结合能力的分析。传统筛选方法是采用表达和不表达抗原的细胞分别进行抗体的结合能力以达到筛选抗原特异性的抗体,譬如利用转染目的基因的细胞和未进行转染的宿主细胞进行反筛选。如果利用已有的筛选平台(例如: ELISA和FMAT),需要进行制备两种板以比较抗体对这两种细胞的结合能力,从而确定抗原特异性的结合能力。

    在该实验中,mirrorball可以在一个细胞微孔板中对多种细胞进行抗体结合能力的测定,以区分抗体对不同细胞的特异性结合。mirrorball的这种多元化分析能力在大大降低实验的成本的同时,可以提高筛选的通量,排除微孔板之间的差异。

实验方法

细胞系和细胞培养

    该文章对表达EGFR受体的的A549和A431两种细胞进行了比较,A549,A431和Jurkat细胞购自Sigma。三种细胞的培养条件如下,A549细胞:含有10%FBS的DMEM,2mM L-glutamine和100U/ml青霉素,100U/ml链霉素;A431细胞:含有10%FBS的EBSS(Sigma),2mM glutamine,1×Non-essential Amino Acids(NEAA)(Sigma), 100U/ml青霉素,100U/ml链霉素;Jurkat细胞:RMPI-1640(Sigma),10%FBS,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素。A431和A549细胞培养到80%的密度时,利用0.25%胰酶和EDTA进行消化,洗涤,重悬到新的培养基中。未有标注的培养试剂均来自于Life Technologies。

抗体和试剂

    鼠抗人EGFR抗体购自Merck Chemical公司(#GR01)。山羊抗鼠IgG,AlexaFluor 647检测标志物(#A21235)来自于Life Technolgy。

CSFE和BiO标记

    将5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester CFSE(sigma)溶解到DMSO中,使得CSFE浓度为100mM。将10nM CSFE加入细胞中,在室温条件下孵育10分钟,接着加入4%PBS(2ml)终止孵育,在37℃孵育10分钟。将细胞进行洗涤,在1000×g转速下离心5分钟。对于细胞计数分析,30nM的DiO(Life Technology)加入分析的混合物中,进行孵育过夜。将细胞进行标记后,在488nm的激光下激发,在FL-1通道中检测细胞的荧光信号。

EGFR实验设计   

    将抗EGFR抗体在细胞培养液中进行梯度稀释,将稀释后的不同浓度抗体20ul加入384孔微孔板中(Costar 3712)。制备含有1.25×105 细胞/毫升的悬浮细胞(A431或者A549)和6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647标记物的混合物。将20ul细胞混悬液分别加入含有抗体的微孔板中,然后将微孔板在37℃孵育过夜。在mirrorball对微孔板进行检测从而确定结合到细胞上的抗EGFR的量。

细胞多重分析实验   

    将20ul稀释后的不同浓度的抗EGFR抗体加入384微孔板中。制备含有相同细胞数的EGFR+A549和CSFE标记的EGFR- Jurkat细胞混悬液(总细胞1.25×105 细胞/毫升,6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647标记物)。该实验是将20ul的细胞混悬液加入含有20ul的抗EGFR抗体的微孔板中(反应孔中的细胞数为2.5×103 细胞和3nM检测标记物)。将微孔板在37℃中孵育过夜后, 放入mirrorball中利用488nm和640nm激光同时扫描检测CSFE染料和结合的抗体的荧光强度。

mirrorball数据收集和扫描

   样品利用mirrorball上的488nm和640nm的激光进行扫描。每个孔的物体可以利用TTP Labtech专利的阈值运算进行在位分析,同时可以提供形态和荧光参数。数据可以mirrorball特有的Cellista 软件通过多种方式进行显示,包括柱状图,散点图,3D荧光强度分布图,整个孔的图片。

结果

EGFR的Mix-and-read 分析的检测灵敏度

    在该研究中,为了在细胞水平结合实验中评估检测的灵敏度,A431和A549细胞,不同浓度的EGFR抗体和Alexa Fluor 647标记的山羊抗鼠IgG共同孵育过夜。图1表明在A431细胞上EGFR抗体的检测浓度为5ng/ml,而在A549细胞上其检测限为5-10ng/ml。这表明EGFR在A549细胞上的表达水平比A431细胞表达水平低。   

    该结果表明利用mirrorball检测抗EGFR抗体的水平和已经退出市场的FMAT的检测结果是一致的。两种检测方法在抗体浓度高于100ng/ml 时均出现总荧光强度降低的现象,该现象的产生是由于文献所说的“钩子效应”。由于一抗的过量存在,从而使得结合在检测抗体的荧光无法读取。

图1. A431/A549上的总荧光强度随抗EGFR抗体浓度增加而加强。

多激光扫描

    mirrorball的三激光使得用户可以利用多种荧光标记的标志物进行细胞计数分析。在该研究中,A549细胞被DiO标记(488nm激光激发),同时利用EGFR抗体和AlexaFluor 647标记物进行多重分析。经过过夜的孵育,利用488nm和640nm双重激光进行细胞数和EGFR标记分析。图2表明在细胞数目恒定的情况下,,细胞的总荧光强度随着EGFR抗体浓度的增加而加强。非常重要的一个特征,细胞数目可以在没有EGFR抗体结合的情况下得到。

图2:A549细胞总荧光强度随着EGFR浓度增加而加强,细胞计数可单独读取。

细胞的多重分析

    mirrorball所独有的多种激光同时扫描特征可以在转染和宿主混合细胞中区分出抗原表达和未表达的细胞群体。为了阐明该方面的特性,在A549(EGFR+)和CSFE标记的Jurkat (EGFR-)进行EGFR抗体的结合筛选实验。在分析之前,将Jurkat细胞进行CSFE(10nM)的染色。图3显示了A549和Jurkat细胞在100ng/ml抗体的结合条件下的3D荧光强度图谱,可以看到EGFR抗体特异性结合到A549细胞,在Jurkat细胞未检测EGFR抗体的结合。

图3: 细胞计数的三维分析。在混合细胞中,mirrorball利用多重激光扫描,可以同时检测A549和Jurkat细胞的荧光信号。

    图4显示利用A549单一细胞和A549,Jurkat混合细胞进行EGFR抗体结合实验,其检测灵敏度的没有明显的差异。

图4:利用单一A549细胞和Jurkat,A549细胞进行EGFR结合实验的比较。利用单一细胞群体和混合细胞对结合实验没有明显的差异。

讨论

    TTP Labtech公司的mirrorball微孔板计数仪为细胞表面抗原抗体的筛选试验提供一种稳健,即混即读的方法。该仪器非常适合抗体的研发,其独有的光学元件和软件设计使得该仪器具有极高检测灵敏度,足够检测低丰度的蛋白的结合实验。

    该文章表明EGFR实验设计非常简单,经过简单的修改即可在mirrorball上进行分析。这种“Mix-and-read”分析方法与传统的ELISA步骤比较可以免去洗涤,孵育步骤,从而大大节省筛选所需要的时间。 同时,该实验采用较少的样品和试剂消耗使得实验的花费大大节省。

    mirrorball是提供多激光同时扫描的第一代分析系统,可以对荧光进行激光之间的矫正。与合适的荧光试剂结合使用,这种多激光的同时扫描的能力可以进行独立的细胞识别和多参数分析,提供筛选的通量,大大降低实验的成本,使得实验操作非常的便利。在该文章中,采用DiO的反染,细胞数目可以不依赖于抗体的结合而直接进行测定,这样可以排除由于细胞接种的不同或者细胞毒性引起的假阳性。

    另外,mirrorball拥有在同一个孔中能够区分出宿主细胞和转染了特定基因细胞的能力,该能力可以极大的加速抗体筛选的进程。mirrorball还拥有在同一孔对A431和Jurkat细胞进行同时检测的能力。 细胞的多重分析拥有很多优势,譬如可以排除不同细胞之间的板间差异,筛选通量增加一倍,减少样品的使用量。

参考文献
1. Lee, R., Tran, M., Nocerini, M. and Liang, M. (2008) A High-Throughput Hybridoma Selcetion Methods Using Fluorometric Microvolume Assay technology. J. Biomol. Screening 13: pp210-17.
2. Bowen, W. and Wiley, P. (2006) Application of Laser-Scanning Fluorescence Microplate Cytometry in High Content Screening. Assay and Drug Development Technologies. 4: pp209-2

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