蛋白质组学

粒细胞溶酶体弹性蛋白酶提取方法(仅供参考,自己翻译的)

粒细胞溶酶体弹性蛋白酶提取方法

溶酶体的提取:

粒细胞提取物(大约1.8×10E10个细胞)溶于500ml 0.2mol/L的蔗糖溶液(含有1mg/ml的heparin sulfate or 100 units/ml).在4℃搅拌24h或16h使细胞充分裂解。由于DNA的释放所得裂解液非常粘稠,而为离心造成困难。

消除方法有两种:

1、室温下加入外源DNAse I;
2、将混合物加热到37℃以内源DNAse除去DNA。

之后将裂解物在1000g离心10min 以除去少量未裂解的细胞以及细胞碎片。上清重新离心30000g 30 min沉淀溶酶体。将溶酶体溶于0.34M蔗糖溶液中,重复低、高速离心。最后将溶酶体冷冻-20℃直到使用。

白细胞溶酶体提取物在0.2M的醋酸缓冲液中匀浆(pH4.0)之后30000g离心10min取上清。重复3次左右,到几乎没有酶再溶出。(测A280衡量<0.02).

Sephrose-trasylol 层析

将溶酶体提取物调节pH 8.0 :1、滴加2M Tris(unbuffered);2、用pH8.0的Tris(0.05mol/L Tris-HCl,0.05mol/L NaCl)透析。第二种方法可得精制的糜蛋白酶混合物,大部分溶酶体中的酶可以被收集。用第一种方法可以收集全部的溶酶体蛋白酶。

将得到的蛋白酶上柱(3.5×15cm),Sepharose-Trasylo:用0.05mol/L Tris-HCl,0.05mol/L NaCl(pH 8.0)平衡。将50ml样品上柱之后,用平衡缓冲液洗脱没有结合的蛋白直到A280吸收小于0.02。用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(0.4mol/L NaCl,pH6.5)洗脱掉微量的其它有吸收的蛋白。Elastase和其它糜蛋白酶结合于柱子上。Elastase 的洗脱是用0.05mol/L 醋酸钠缓冲液(0.4M NaCl,pH 5.0);糜蛋白酶的洗脱使用pH 4.5的上述缓冲液洗脱。

如果原料没有经过透析的话,elastase洗脱液中经常会含有少量的糜蛋白酶。不含糜蛋白酶的情况下elastase 的活性为20.0,含为16.0-12.0。后面的结果表明经过以上步骤纯化出的酶对于大部分生化研究已经达到足够的纯度。

CM-Cellulose chromatography

为了检查每个elastase 同功酶的特性,将elastase 进行进一步的CM-纤维素离子交换层析。将elastase同功酶用0.02mol/L醋酸钠(0.15M NaCl,pH5.5)透析,之后加入到CM-cellulosis柱,用同样的缓冲液平衡。所有的蛋白都结合到柱上,并且用平衡液洗不会洗掉任何蛋白。混合的elastase同功酶可以通过梯度洗脱来分离,洗脱液为:0.02mol/L醋酸钠(0.15M-0.3M NaCl,pH5.5),形成梯度之后用高盐浓度的缓冲液将最后的主要弹性蛋白酶组分洗掉。之后用0.02M 醋酸钠(1M NaCl,pH5.5)将白细胞糜蛋白酶洗脱,如果初始的提取物有的话。

原文:Human leukocyte Granule Elastase:Rapid Isolation and Characterization.Robert J and James Travis,Biochemistry Vol.15,No 4,1976

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