蛋白质组学

磷酸化的Akt不见了!!

 

这俩天做实验,极其郁闷。我做的总AKt和pAkt,大鼠脑组织,第一次跑总AKT的时候,我觉得可能是因为蛋白是提取的浓度比较好吧,出来了一条浓浓的条带,三组总AKt都出了,接下来做pAkt,就出了一个带,效果挺明显的。后来再做pAkt的时候,跑了4张膜,显影的时候,太干净了,上面什么都没有,甚至连个杂带,斑点 都没!实验是在实验员的领导下完成的,技术上基本没什么纰漏,查阅本版面有关这问题方面的介绍,有的解释说pakt降解了!一抗是用的Phospho-Akt(Ser473)(193H12)Rabbit mAb,1:300,稀释,二抗是驴抗兔,1:2000,我是实验室的新手,刚呆俩月,受 此挫折,一头雾水,请过来人或者有经验的同学帮忙解答怎样解决,非常感谢!

pAkt有两个位点,Ser473和Thr308,其中Ser473相对容易显色。如果显色失败,可能的原因:1 上样量过少,我们一般都是30μg;2 一抗孵育时间过短,我们一般24h~48h;3 一抗是否工作有待排除

碧峤 wrote:
pAkt有两个位点,Ser473和Thr308,其中Ser473相对容易显色。如果显色失败,可能的原因:1 上样量过少,我们一般都是30μg;2 一抗孵育时间过短,我们一般24h~48h;3 一抗是否工作有待排除

我上样量上的15ug,一抗孵育大约18个小时,就是头天下午孵育上,第二天早上就洗膜了,之前做过一次pakt,一样的过程,出了一次,再以后就没出了。今天我们换了下不同组的同一组织,比较新,试下,不知道明天出不出结果。。。

换了新蛋白,还是没出结果。我们连做了3次,第4次跑了俩胶,一块胶还用原来的旧2抗,是进口2抗,另外一块胶借了点同学的国产2抗,结果是国产2抗那个结果出了,进口2抗那个没出结果,和前3次一样,漆黑一片。原来是我们的2抗失效了。简直给我们坑苦了!新的2抗还在路上,预计一个月到达。所有有关实验暂停!简直郁闷!

二抗怎么会要一个月,我们的今天打电话明天就到

bianbenjamin wrote:
二抗怎么会要一个月,我们的今天打电话明天就到

你好,你们在哪订的抗体啊,我们订的进口抗体。。

国产的 也至少一个礼拜吧。。
关键 我老板不用国产的,坑苦了。。

bianbenjamin wrote:
二抗怎么会要一个月,我们的今天打电话明天就到

有些抗体有现货,有些抗体没有现货,需要订购。

只有等着了。。

中山金桥,北京的,他们的二抗也是jakson分装的,我个人觉得二抗没有那么关键。

今天做上了。。问公司要了点进口分装的。。明天看出不出结果了。。晕

出结果了!结果条带比较杂,但是p-akt还是比较清楚的!另外,出现诡异现象就是,无法解释!糖尿病组胰岛素信号通路IRS-1位点是上调,而出现的p-akt 丝氨酸位点是下调表达,怎么解释这个现象呢?迷糊

Akt 和p-akt 全部做完了 哈哈

米宝 wrote:
Akt 和p-akt 全部做完了 哈哈

您好!两者是什么趋势呢,是总的差不多,磷酸化的降低吗?谢谢!
我最近也在做着两个,真的好难做啊!

请问下各位大哥大姐,经费有限可以省去总的Akt吗?谢谢啦

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