蛋白质组学

植物总蛋白提取方法

提取植物总蛋白(以植物花粉为例):
1.三氯乙酸法(TCA)/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末,用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质,-20度 2个小时(必要时过夜),4度 25000g离心20min后去上清,用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀,-20度 1个小时,再次离心去上清,将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea,20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时,20度25000g离心20min,收集上清,沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清,可为后续试验做准备。

2.苯酚(phenol)提取法
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末,添加1ml的phenol(tris 8.8 缓冲液)继续研磨5min,加提取缓冲液(0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl,5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose)。将样本转移至离心管中,4度 震荡30min,25000g离心10min,将上层的phenol层转移进另一个试管,将下边的水相层加1ml的phenol(tris 8.8 缓冲液)及提取缓冲液,震荡,离心,将再次收集到的phenol与前边收集的混合,加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol,在-20度震荡沉淀蛋白质,必要时过夜,4度 25000g离心10min,将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次,在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬— -20度震荡30min,4度 25000g离心20min,洗剂完成后,沉淀真空干燥,IEF buffer提取蛋白质,如方法1。

3.直接IEF buffer提取蛋白质
直接IEF buffer提取蛋白质,花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末,然后加入IEF buffer(8M尿素,20mmDTT,4%CHAPS,5mmEDTA,5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。

4.Tris-HCL缓冲液法
花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末,加入Tris-HCL缓冲液(50mm,8.8,Tris-HCL, 5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF),在融化后,混合液在4度放30min, 25000g离心20min,收集上清,对沉淀重新提取一次,将收集到的上清混合,用5倍体积的100%丙酮沉淀蛋白质,-20度孵育2h,离心后,用80%的丙酮洗剂沉淀2次,IEF buffer重悬沉淀,方法如1
利用Bradford试剂法估测提取的总蛋白浓度,并调整浓度行蛋白电泳,-80度保存。
个人经验方法1和方法2比较好用,具体见附件!

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