蛋白质组学

胰酶分离提取,进口胎牛血清提取制备酶的经典方法

进口胎牛血清提取制备酶的经典方法,多采用硫酸铵分级沉淀,胰酶在 75% 饱和度硫酸铵中沉淀,其它杂蛋白一般在 10% 硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取,后在 PH8.0peng 酸缓冲液中得到结晶。

本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验,掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。

1、胰蛋白酶原的提取与分离:称取 1-1.5 Kg 新鲜猪胰脏,在冰浴下剥除脂肪和结缔组织,在低温下用绞肉机绞碎胰脏 (或用高速组织匀浆机捣碎) 加 1-2 倍体积以预冷却的 PH2.5 - 3.0 乙酸酸化水溶液提取 (按 1 g 组织相当于 1 ml 体积计算,以此类推)。检查提取液中 PH,若高于 PH3.0 时应及时用 10% 乙酸调节,使提取液维持 PH2.5-3.0 之间。在冷室 5℃ 左右搅拌提取 18-24 h,而后用 4 层纱布过滤,尽量拧挤出滤液,滤液呈乳白色,用约 300 mlpH2.5 乙酸酸化水再提取残渣一次 (时间约为 1-2 h),合并滤液,此时滤液 PH 值较高,可用 5M H2PO4 溶液调整 PH 至 2.5-3.0,放置 3-5 h 后,浑浊滤液冷却后,用玻璃漏斗进行自然过滤,滤液呈黄色透明液体,收集滤液,量其总体积,弃去沉淀物。

2、盐析:滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析,使溶液至 75% 饱和度。盐析溶液放冷室中过夜,次日用 4000r/min 离心机离心,或用布氏漏斗抽滤,滤饼经压干后称重,可得约 20 g 胰蛋白酶原粗制品。

3、胰蛋白酶原得激活:将胰蛋白酶原粗制品用 10 倍体积得冷蒸馏水,分多次加入使滤饼溶解,溶液呈乳白色,量其体积,取出 1 ml 溶液用于测定,溶液中硫酸铵得含量 (约为滤饼重得 1 / 4)。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合,生成硫酸钙,如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程,按浓度量计算,将已研细的固体 CaCL2 慢慢加入酶原溶液中,边加边搅拌均匀。用 5MNaOH 溶液调 PH 至 8.0。在酶溶液加入约 5 mg 结晶猪胰蛋白酶,轻轻搅拌均匀,置 5℃ 冰箱中使酶原活化。

4、纯化:去除杂蛋白,量取胰蛋白酶溶液体积后,用 5M 硫酸溶液调节滤液 PH 至 2.5-3.0,抽滤除去硫酸钙沉淀,滤液体积约 1000 ml,加入已经研细的硫酸铵粉末,使其溶液达 40% 饱和度 (每升滤液加 242 g 硫酸铵)。放置 5℃ 冰箱中 5-8 h, 抽滤除去沉淀。

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