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如何区别几种不同蛋白互作实验方法(IP/Co-IP/GST pull down)?

如何区别几种不同蛋白互作实验方法(IP/Co-IP/GST pull down)?

发布时间:2021/4/25 作者:

理论知识点看了多遍,但还是分不清IP,Co-IP,GST pull down?在下文除了介绍介绍IP与Co-IP区别知识要点,也将研究蛋白互作几种方法(酵母双杂交系统(Y2H),CO-IP的关系,GST-Pull
Down)之间的区别以及优缺点简明扼要的收纳进来。

 

独角戏——IP:

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)就是用偶联相应抗体的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下来,然后去检测它。例如蛋白X在细胞内的蛋白量不同,或者有着不同的翻译后修饰,这时就可以用X蛋白抗体+Prorein
beads来进行IP,从细胞中把蛋白X拉下,再用特异的抗体(如磷酸化,泛素化抗体)进行WB来检测蛋白X的变化。简言之,IP就是检测单个蛋白的状态(高矮胖瘦,有没有戴帽子,穿的什么衣服等等)。

 

免疫沉淀

众里寻她千百度——酵母双杂交系统(Y2H):

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与,真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域:DNA 结合结构域(DNA binding domain,DNA-BD)和DNA转录激活结构域(Activation domain,AD),这两个结构域可以独立分开,功能互不影响。BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应,只有当二者在空间上充分接近时,才呈现完整的转录激活因子活性,使下游基因得到转录。根据这一原理,可设计酵母双杂交系统。

 

将两待研究蛋白(蛋白 X 与蛋白 Y)分别与 BD、AD
结构域构建融合质粒。将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达,如果两蛋白之间不存在相互作用,则下游基因(报告基因)不会转录表达;如果两个蛋白间存在相互作用,则BD与AD两结构域空间上很接近,从而下游基因(报告基因)得以转录。通过报告基因表达与否,即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。

 

通常在现实情况中,与蛋白X存在潜在互作可能的候选蛋白会有好几种(Y,Z,A,B等),这时我们就可以通过酵母双杂交在体内筛选与X有相互作用的蛋白Y。

 

酵母双杂交系统

 

遇见爱情——Co-IP:

竟然我们在体内验证过,那么蛋白X和蛋白Y在体外是否也存在相互作用了?这个时候我们可以用到Co-IP了~

 

免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)的原理和IP是一样的,当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来,假如细胞内存在 XY 蛋白复合物,用 X(X也称为诱饵蛋白)的抗体免疫沉淀 X,那么与

 

X 在体内结合的蛋白质 Y(Y也称为靶蛋白)也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入 X 的抗体沉淀蛋白X,随后利用蛋白印迹(western blot,WB)检测沉淀中是否存在蛋白 Y,如果存在,则说明细胞内存在XY蛋白复合物,即蛋白XY存在相互作用。(在体外验证X和Y之间有联系)

 

免疫共沉淀

免疫共沉淀(Co-IP)

在我们用酵母双杂交和Co-IP双保险验证X和Y之间确实存在相互作用后,我们发现酵母双杂交和Co-IP的结果都只能说明X和Y之间有相互作用,但并不能确定这种相互作用是直接的还是间接的,这个时候存在两种可能:

X与Y之间存在直接的相互作用(X和Y自由恋爱一见钟情)

也就是说也许是X与M相互作用,而Y也和M相互作用,这样,用A的抗体可以把M拉下来,但同时M又把B也拉下来了(X和Y是通过他们共同的朋友M介绍才认识然后在一起的)

要想准确确定X和Y直接的作用到底是直接的还是间接的了,这个时候我们需要祭出我们大boss——GST pull down实验~

 

GST pull down:

GST pull down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术, 近年来越来越受到广大学者的青睐。

 

原理:将靶蛋白和GST组成的融合蛋白固定在谷胱甘肽(GSH)亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得,此方法简单易行,操作方便。

 

GST-Pull Down

 

 

如何选择:

Co-IP,GST pull down和酵母双杂交是研究蛋白互做最常用的三种方法,一般常用酵母双杂交来筛选,用Co-IP和GST pull
down用来验证。研究不仅在整体蛋白层面,还包括蛋白的结构域层面,GST pull
down是用来验证蛋白X与Y是直接结合的,而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。

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