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定量PCR,Cq(Ct)值的常见问题解答

如果您要进行定量PCR(qPCR),那么了解Ct值。下面 我们将带您了解它在qPCR中的关键作用。

一、在深入解释Ct值是什么之前,我们想花一点时间强调一下,多年来该值已被赋予多个名称,包括:

1.Ct–循环阈值

2.Cp–交点

3.TOP-分支点

4.Cq–定量循环

这几个名字表达的都是一个意思。由于实时定量qPCR实验指南建议使用Cq值来命名该值,因此,接下来的内容,我们将统一使用Cq值来表示。

 二、Cq值的定义 

实时荧光定量PCR 是将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后,完成高温变性,低温复性,适温延伸的热循环,并遵守聚合酶链反应规律,与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断,荧光素游离于反应体系中,在特定光激发下发出荧光,随着循环次数的增加,被扩增的目的基因片段呈指数规律增长,通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度,求得Ct值,同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照,即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

1.阈值:

以 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,一般荧光域值定义为 3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

2.CT值:

也称循环阈值,C代表Cycle,t代表threshold。其含义是:在PCR 循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

 

三、常见问题

1.预混液

Cq值会随着荧光发射的变化而变化,而荧光发射受溶液中pH值和盐浓度的影响,因此,请确保仅使用高质量的PCR组件,如使用自制溶液,每次实验前要检查pH值和盐沉淀监测。

2.被动参比染料

反应值是FAM荧光染料与ROX参比染料的比值。假设FAM荧光不变,ROX的用量越少,反应值越高。

3.模板太少–尝试使用更多模板。

参考文献

1.Bustin SA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009. 55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.

2.C. Schrader, et al. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J Applied Microbiology. 113(5):1014-26. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x.

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