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Matthias Mann:快速高深度DIA蛋白组学全面表征酵母蛋白质组

酿酒酵母是功能强大的模型物种,可用于系统性的生物学筛选和大规模蛋白质组学方法开发。随着质谱技术的进步,酵母的全蛋白质组覆盖几乎完成。然而,对酵母蛋白质组进行快速高通量分析仍然具有挑战性。2020年11月著名蛋白质组学领军人物德国马普生物化学研究所Matthias Mann教授联合Brenda A. Schulman教授和Christine R. Langlois教授共同在PNAS(IF 9.412)杂志上发表题目为 《DIA-based systems biology approach unveils E3 ubiquitin ligase-dependent responses to a metabolic shift》的研究成果,介绍了一种快速高深度DIA蛋白质组检测技术,实现酵母全蛋白质组的超高覆盖度。利用此技术既可以全面表征酵母蛋白质组响应环境扰动的变化,又可以精确识别单个缺失或点突变对整个蛋白质组的影响。

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研究材料

酿酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)

技术方法

快速高深度DIA蛋白质组+转录组

实验路线图

研究结果

1、快速高深度DIA检测技术方法开发

研究者在Orbitrap质谱仪上对DIA整体流程进行了探索。为了生成酵母的综合图谱库,研究者在各种生长和胁迫条件下培养酵母细胞,经提取消化后,通过反相(RP)色谱法将每种条件下获得的肽段分为8个馏分。使用DDA方法以23min的液相梯度检测64个馏分(8个馏分×8个条件),通过Spectronaut软件建立酵母DIA library(74,103条肽段,4712个蛋白,覆盖酵母全蛋白组的87%;中值序列覆盖率为27%,每个蛋白质平均检测到12个肽)。基于此library,23min DIA检测(六次重复)平均可鉴定到33,909个肽段,3,413个蛋白,这与180min DDA检测结果相近(33,425个肽段和3,435个蛋白)。

快速高深度DIA检测技术方法开发流程与检测能力

2、技术能力测评一:不同处理条件下酵母大规模蛋白组学分析

研究者对不同处理条件下(不同培养基,热胁迫,渗透压胁迫,碳饥饿,氨基酸饥饿和氮饥饿等)的酵母进行大规模蛋白组学分析,共定量到3,506种蛋白质;数量统计发现在所有组别中检测到的蛋白超过90%的定量一致。功能分析发现每种处理都会引发不同的响应,造成不同蛋白的合成与降解,这些变化结果与预期调控变化一致。这也证明研究者开发的这种快速高深度DIA方法可以准确定量已知差异蛋白,为酵母研究人员提供了近乎全面的数据资源。

不同处理条件下酵母大规模蛋白组学分析

3、技术能力测评二:挖掘GID E3连接酶的调控新机制

研究者进一步探索葡萄糖饥饿及恢复过程中酵母蛋白组学变化,检测结果共定量到3,602种蛋白质。通过与转录组学数据比较,发现在转变过程中酵母细胞首先通过基因快速转录,产生新蛋白质,然后降解不再需要的蛋白。深入分析后发现GID E3连接酶的Gid4亚基受到碳源调控,后续通过对Gid4突变体和Gid2K365A突变体酵母的葡萄糖饥饿前后蛋白组学检测证实GID E3连接酶具有碳源依赖性的调节功能。研究者最后通过蛋白组学联合启动子参考技术(promoter reference technique)发现了GID E3连接酶新的调控靶标:Acs1和Aro10。

DIA蛋白组学解析GID E3连接酶的调控新机制

小编小结

本研究建立了一套简单易行的蛋白质组学分析流程:快速高深度酵母蛋白质组DIA分析技术。它为酵母研究人员提供了近乎全面的数据资源,既可以准确定量已知蛋白差异,又能够揭示调控新机制。尽管此方法是在酵母中开发的,但该技术的快速,简便及可扩展性使其适合于任何细胞系统中的检测,尤其在是缺失或突变体或其他干扰的机制研究方面,可以获得更加全面的生物系统响应信息。

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