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Label-free的华丽升级之系列报道一

-江湖纷争--iTRAQ vs TMT-

在大规模蛋白质组定量分析领域,风头最盛的分析技术非iTRAQ / TMT莫属。通过将不同样本酶解后的肽段进行不同的稳定同位素标记,iTRAQ / TMT可实现多个样本合并进行分析,从而实现高度的分析平行性。

在此基础上,通过SCX或hpRP分级手段,iTRAQ / TMT的应用可带来更丰富的定性定量数据。比常规Label free更好的分析平行性、更丰富的数据结果,比SILAC更容易实现的操作,造就了 iTRAQ / TMT成为非靶向大规模蛋白质组定量的代名词的地位。

然而,即使在iTRAQ/TMT盛行的今天,仍有那么一群蛋白质组的技术控,保持着对技术方法的深刻理解和认识。我们的原则是:在科学界,合适比流行更重要,否则审稿人会代表学术消灭你…..

 Why? 

从几年前的一起案件说起

① 案情介绍(真实案例,拒绝胡诌)

N种动物的乳汁,找出不同动物乳汁的差异蛋白。采用iTRAQ标记技术对N种乳汁酶解后的肽段进行标记,然后合并进行LC-MS分析。结果,审稿人认为其中某些蛋白理论上并不应该在某些物种中表达,但是在iTRAQ的结果中显示该蛋白有定量数值,实际结果与常识不符审稿人认为该分析不适合采用iTRAQ技术,退稿处理

被告(iTRAQ):表示一脸懵逼

② 案情分析

由于iTRAQ标签平衡基团的存在,不同动物的乳汁经标记并混合后,其肽段的分子量完全相同,即在一级质谱上无法区分同一肽段是来自于哪种乳汁的,仅能通过二级质谱中不同iTRAQ报告基团的信号和intensity,来判断肽段的存在与否以及定量上的差异。

但是,由于二级质谱信号噪音的存在,以及iTRAQ算法及其后期归一化的校正过程,会导致即使某种乳汁中不表达某个蛋白,即肽段实际没有被对应的标签标记上,该蛋白也会被赋予一定的定量值,造成“误解”。

iTRAQ不适合分析不同物种(即使亲缘较近)的差异比较分析。

(上述论点同样适用于TMT)

③ 案情延伸

由于采用将不同样本合并上机的操作流程,且将蛋白的表达水平转换为标签比值的特殊算法,iTRAQ并不适用于所有的差异比较分析目的,如果大家有如下特殊分析情况或需求,建议采用Label free:

1. “有无差异分析”:如可能存在一组样本中有该蛋白表达,一组样本中不能检测到该蛋白表达的情况(可能为无表达,也可能为技术方法未能检测到的极低表达);

2. 样品间蛋白pattern有明显差异:如不同物种、不同类型样本;

3. 宏蛋白质组学分析:样本由多种(不同)微生物物种共同构成;

4. 需要知道蛋白的绝对丰度的情况:如同一样本中不同蛋白间的丰度range比较,计算蛋白的拷贝数或绝对定量分析等。

(切记!切记!切记!)

④ 选择label-free的理由

Label-free之所以能够实现上述分析,来自于其天然未修饰的技术本色下面一段话要敲黑板谨记于心:

【相比于iTRAQ/TMT等标记定量方法,Label-free是从shotgun定性分析技术直接衍生而来,其直接反应样本中蛋白、肽段的原始表达信息,能够准确体现样本内蛋白的表达情况(相比而言,iTRAQ存在压缩表达差异程度的情况),且其定量值与蛋白的绝对水平存在线性关系(如通过iBAQ值和同位素内标,可实现蛋白质组层面的绝对定量分析,Nature. 2011 May 19;473(7347):337-42)。】

(有些时候,天然美,才是真的美!)

原告:终于搞明白是怎么挂的了。但是,对于复杂样品而言,如何像 iTRAQ / TMT一样获得更多的数据呢?请看下期分解:

▼▼▼▼

低调了很久的那位(Label-free):谁说我不能分级!!!

其实结局并没有大家想的那么完美

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